杨荣志 谭 君 杨华勇 吴 钢 余康进 杨俊品

（1 阿坝州农业科学技术研究所，四川马尔康 624000；2 四川省农业科学院作物研究所，成都 610000）

玉米是我国主要的粮饲兼用作物，尤其是在农业生产条件较差的高原地区和高寒山区，玉米生产在粮食稳定中的地位更加突出。中纬度高原地区由于特殊的地理条件和人们对饮食的需求，需要生育期短、品质优的玉米品种；传统选育在材料上具有较强的独立性，外来资源少，对本地区地方种质资源的依赖性较大，但长期以来较为单一的杂交模式给玉米育种工作的突破带来了难度[1-2]。

近年来，随着现代分子标记技术在农作物研究中的成熟应用，各地利用分子标记技术研究玉米种质资源遗传多样性的报道很多[3-4]，但中纬度高原地区中早熟玉米种质资源作为特殊的遗传类型，分子水平研究报道较少[5]。本研究利用SSR 分子标记技术，对27 份川西高原传统利用和新近育成的中早熟玉米自交系以及5 个标准测验种进行研究，分析种质资源间的遗传关系，在此基础上建立杂种优势群，为这一地区今后的玉米育种工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料供试材料包括川西高海拔地方种质的自交系或地方种质改良自交系9 份，外来血缘选育的中早熟自交系13 份，引进中早熟自交系5 份，以及我国主要玉米杂优模式群体代表自交系5 份（表1）。

1.2 试验方法试验于2016 年进行。在玉米1～2 叶幼苗期剪取茎叶，采用国际水稻研究所提出的CTAB法提取DNA。PCR 扩增反应及产物检测：反应体系15μL，其中含1×Buffer，2.5mmol/L MgCl2，0.4mmol/L dNTP，SSR 引物（前引物和后引物）各3.3ng/μL，0.5U Taq DNA 聚合酶，70ng DNA 模板。反应程序采 用SSRMethod（http：//www.agron.missouri.edu）提供的方法，95℃预变性10min，1 个循环；95℃变性1min，65℃退火1min（以后每个循环降低1℃），72℃ 1.5min，11 个降温循环；95℃变性1min，55℃1min，72℃ 1.5min，共30 个循环；最后在72℃延伸10min。反应结束后，用4.5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳在1×TAE 缓冲液中恒定85W 电泳45min，然后银染和显影照相。

表1 32 个自交系名称及系谱来源

1.3 数据分析根据引物扩增和电泳分离结果，建立SSR 的0-1 数据库，每一个引物检测一个染色体位点，每一个条带视为一个等位基因，在相同迁移位置上（相同的分子量片段）有带的记为1，无带的记为0，缺失的记为9。采用Jaccard 系数的方法计算遗传距离（GD，genetic distance），遗传相似系数（GS，genetic similarity）GS=1-GD，采用类平均法（UPGMA）进行聚类作图[6-7]，数据处理用DPS7.55 完成。

2 结果与分析

2.1 SSR 标记检测结果本研究应用74 对SSR 引物对32 个玉米自交系进行扩增，其中63 对引物多态性好、带型稳定，其余11 对引物因为扩增效果较差，不能进行统计。统计的63 对SSR 引物分布于玉米10 条染色体上[6-8]，共检测出298 个等位基因变异，每个引物检测到2～10 个等位基因，平均每个位点检测到的等位基因数为4.73 个。在10 条染色体上分别检测了7、5、9、5、6、6、5、6、5、9 个位点，分别检测出36、20、37、25、32、35、21、28、17、47 个等位基因（表2）。图1 为引物umc1506 对32 个自交系的扩增图谱。

2.2 遗传距离利用Jaccard 法计算得到32 个玉米自交系的SSR 遗传距离范围是0.31～0.79，平均遗传距离为0.55，表明供试的玉米自交系存在较大的遗传差异。

2.3 聚类分析根据32 个自交系的SSR 遗传差异系数矩阵，利用UPGMA 法进行聚类分析，结果如图2 所示。在遗传距离0.75 处，32 个自交系可以分为5 类，在遗传距离0.73 处，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类又各分为2 个亚类，各类包含的自交系见表3。

从系谱亲缘关系分析，SSR 聚类结果与系谱追踪具有较好的一致性。其中，沃30 和沃抗L 都是来源于阿坝州纯地方资源沃日抗旱玉米，92115、8111沃、97-81 都是沃30 的改良系，不同程度含有该地方血缘，试验结果也表明它们之间遗传距离小，聚为一类；LBH-71、LMB-72 是凉山州两个地方种质的改良系，结果也和沃30 等自交系共同聚在第Ⅰ类，而第Ⅰ类中没有其他外来自交系和标准测验自交系归入，说明川西高海拔地区地方种质资源遗传类群相对独立。丹340 和330 在聚类结果中归为一类，与前人相关研究报道一致[9-10]，汶顶313 是汶川白玉米和330 的杂交后代，和330、丹340 一起聚在第Ⅱ类1 亚类；在第Ⅱ类2 亚类中，41、41330、9-432都含有Mo17 血缘，阿自50 是41 和1034 的杂交后代，聚在一起比较合理，4H43、4643 都是446 和oh43 的杂交后代，和Mo17 聚在一类的原因有待进一步研究。JZ-223、MA17、D616 都是国外中早熟杂交种选育的自交系，试验结果同聚于第Ⅲ类1 亚类；P6113 和47813 同有太系113 血缘，47813 又有478 血缘，和478 一起归在第Ⅲ类2 亚类。卡142、早28 都是加拿大早熟杂交种选育的自交系，归在第Ⅳ类；WO98是丹598的后代，两自交系聚在第Ⅴ类；9021、6131、8641、2417、216 为新引进自交系，亲缘关系不详，分别被聚到不同的类群中。

表2 63 对SSR 引物在32 个玉米自交系中检测到的基因数

3 讨论

3.1 中纬度高海拔地方种质资源研究与利用目前，我国玉米育种在资源利用上绝大部分还是以兰卡斯特、瑞德、旅大红骨、唐四平头、PN 等为主[9-10]，遗传基础比较狭窄，众多的地方资源没有得到有效利用[11]。通过本研究的SSR 聚类结果可以看出，供试的中纬度高海拔地方种质资源不能归入国内目前主要应用的杂种优势群体，属于一个相对独立的遗传群体，因此可以推测，高原中早熟地方种质与我国主要的杂种优势群体都应有较好的杂种优势。高海拔地区生态气候复杂，土地干旱瘠薄，地方玉米种质在当地具有适应性好、品质优等外来血缘不具备的优点，但是在育种实践中也发现，多数高原地方种质资源抗病抗倒性较差，抗性、株型等缺陷难以保障在生产中直接利用[12-13]。因此可以根据本研究的聚类结果引入外来种质资源对地方种质进行定向改良，同时还应加强其他地方资源的收集和研究工作。

表3 32 个玉米自交系的SSR 聚类结果

3.2 SSR 聚类结果在杂种优势利用实践中的体现供试的中早熟自交系中有6 个自交系已经在中纬度高海拔地区组配出杂交组合并通过品种审定应用于生产，其中地方资源沃30 组配出了阿单4 号（oh43×沃30）、阿单8 号（41×沃30）、金单四号（沃30×Mo17），92115 组配出了阿单9 号（446×92115）、阿单11 号（阿自50×92115），8111沃组配出了阿单12 号（Mo17×8111 沃）、阿单14号（41×8111 沃），这些组合多数都是高原地方种质与兰卡斯特种质的优势体现，也与本研究中高原地方种质独立于兰卡斯特群体的结果吻合。

3.3 本研究成果对今后高原玉米育种的指导和设想高原地方种质相对独立，因此在以后的育种实践中，还应加强该类群同瑞德等其他杂种优势群的利用研究。另一方面，新育成和新引进的自交系在本研究中进行了明确归类，今后要利用这一研究成果并结合田间配合力测定等工作为中纬度高海拔地区玉米育种提供指导。