张斌　韩敏　相德才　刘韶娜　沙茜　张桂生　赵智勇　赵彦光

摘要：【目的】明確自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1基因（Nramp1）多态性对其在滇陆猪群体各组织中表达的影响，从分子遗传学角度阐述滇陆猪不同基因型个体对疫病免疫的遗传差异，为其抗病育种选育提供参考依据。【方法】采用PCR对27头滇陆猪Nramp1基因进行扩增，以DNASTAR 5.0进行序列比对分析及多态性（SNP）位点检测;同时利用实时荧光定量PCR检测Nramp1基因在滇陆猪各组织中的相对表达量，并运用SPSS 19.0分析Nramp1基因多态性对其在滇陆猪群体各组织中表达的影响。【结果】在滇陆猪Nramp1基因第5外显子、第5内含子和第6外显子上分别发现SNP1（T→C）、SNP2（A→G）和SNP3（G→A）等3个SNPs位点，都只存在2种基因型，且SNP1位点和SNP3位点在试验猪群体中属于低度多态[多态信息含量（PIC）/杂合度（He）<0.25）]，SNP2位点属于中度多态（0.25

关键词： 滇陆猪;自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1基因（Nramp1）;多态性位点（SNPs）;基因型;组织差异表达

中图分类号： S828.89                        文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）01-0202-07

Abstract：【Objective】To clarify the effect of polymorphism of natural resistance-related macrophage protein 1 gene （Nramp1） on its expression in tissues of Dianlu pig， aiming at elaborating the genetic differences of different genotypes of Dianlu pigs on disease immunity from the perspective of molecular genetics， and providing a reference for disease resistance breeding. 【Method】The Nramp1 gene of 27 Dianlu pigs were amplified by PCR，and the sequence alignment analy-sis and the polymorphic sites（SNP）were detected with DNASTAR 5.0. Meanwhile， the real-time quantitative fluorescence PCR（qPCR） was used to detect the relative expression of the Nramp1 gene in tissues of Dianlu pigs， and the SPSS 19.0 was used to analyze the effect of Nramp1 gene polymorphism on its expression in the tissues of Dianlu pig. 【Result】Three SNPs of SNP1 （T→C）， SNP2 （A→G） and SNP3 （G→A） were found on the 5th exon， 5th intron and 6th exon of the Nramp1 gene in Dianlu pig， respectively. There were only two genotypes in each polymorphism. The SNP1 and SNP3 were at low polymorphism [polymorphism information content（PIC）/heterozygosity（He） <0.25] and SNP2 was at mo-derate polymorphism （0.25<PIC/He<0.5） in the experimental population. There were significant differences in the relative expression of the Nramp1 gene among the tissues of Dianlu pigs（P<0.05， the same below）， that showing lung>liver>spleen>heart. In addition， the tissue-differential expression of the Nramp1 gene in different genotype groups of Dianlu pig was also different， especially the Nramp1 gene expression in the liver of homozygous group at SNP2 was significantly lower than that of heterozytous group， indicating that the variation of the Nramp1 gene polymorphism site had significant effect on its expression in the tissues of Dianlu pig. 【Conclusion】The variation of the Nramp1 gene SNP can influence Nramp1 gene expression change in the tissues of Dianlu pig， thereby affecting the immune response reaction of Dianlu pig body. SNP2 site can be used as a molecular marker for disease resistance breeding in Dianlu pig.

Key words： Dianlu pig; natural resistance-related macrophage protein 1 gene（Nramp1）; polymorphic sites（SNPs）; genotype; tissue differential expression

Foundation item：Yunnan Key Research and Development Project（2018BB003）;Yunnan Application and Basic research Project（2017FD055，2018FD001）; Basic Research Project of Yunnan Animal Science and Veterinary Institute（2019RW012）

0 引言

【研究意义】滇陆猪是云南省自主培育成功的新品种，具有产子多、肉质好、生长速度较快、母性强及瘦肉率高等优势（国家畜禽遗传资源委员会，2011），但在大规模集约化养殖过程中其面临的问题也逐渐凸显，尤其是各种流行病害（猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪细小病毒病和猪支原体肺炎等）对其养殖业带来的危害。针对相关疫病的发生与流行虽然可通过疫苗免疫进行预防，但在免疫力选择下会不断产生优势致病性菌（毒）株（Escudero et al.，2007;张雪花等，2018），且这些病原体极易污染并长期存在而难以清除。因此，迫切需要对滇陆猪实施抗病育种选育，为促进其养殖业的可持续健康发展提供保障。【前人研究进展】自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1基因（Nramp1）是Vidal等（1993，1996）在近交小鼠中发现的一段较保守基因序列，是Nramp基因家族成员之一。猪Nramp1基因由15个外显子和14个内含子组成（Wu et al.，2007），且有研究发现该基因第6个内含子NdeⅠ限制性位点的多态性变异不仅与猪免疫功能存在显著相关性（Wu et al.，2008），还与仔猪腹泻的发生发展密切相關（赵生国等，2013;古少波等，2017;罗兴等，2017）。此外，Ding等（2014）采用PCR-RFLP对皖南黑猪、淮猪和渭猪的Nramp1基因进行研究，结果表明该基因的g.130 C>T位点和g.657 A>G位点变异与单核细胞百分比、中间细胞百分比及CD4/CD8 T淋巴细胞等血液免疫性状相关。戴超辉等（2017）从细胞水平探讨Nramp1基因与仔猪腹泻的相关性，结果发现猪肠道上皮细胞经不同大肠杆菌刺激后，Nramp1基因在肠道上皮细胞中的表达量呈不同倍数的上调变化。Wen等（2018）对猪的Nramp1蛋白结构及其氨基酸序列进行研究，结果发现约克夏猪与藏猪存在抗病性差异，其原因可能是约克夏猪Nramp1蛋白的跨膜结构域及三级结构与藏猪Nramp1蛋白相比存在显著差异。可见，Nramp1基因可作为猪分子抗病育种的候选基因。【本研究切入点】至今，有关Nramp1基因的抗病性虽然已从DNA或mRNA层面在不同猪品种上得到验证，但有关其DNA多态性与mRNA表达量的相关性尚无研究报道。【拟解决的关键问题】通过PCR扩增及实时荧光定量PCR检测等方法分析Nramp1基因多态性变化对Nramp1基因在滇陆猪群体各组织中表达的影响，旨在从分子遗传学角度阐述滇陆猪不同基因型个体对疫病免疫的遗传差异，为其抗病育种选育提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

以随机挑选不同母本的6月龄滇陆猪为试验材料，共27头，采集其耳组织，置于装有75%酒精的离心管中，-70 ℃保存。同时对27头滇陆猪进行屠宰，采集其心脏、肝脏、脾脏和肺脏等组织样品，立即置于装有RNA Save液的离心管中，-70 ℃保存。

1. 2 滇陆猪Nramp1基因多态性检测

1. 2. 1 基因组DNA提取及检测 参照天根生化科技（北京）有限公司的组织DNA提取试剂盒说明，提取滇陆猪耳组织样品的基因组DNA，并以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行提取效果检测。

1. 2. 2 引物设计 参照GenBank已公布的猪Nramp1全基因序列（NC_010457.5），采用Primer Premier 5.0设计扩增滇陆猪Nramp1基因的特异性引物（F1：5'-TTCCAGCCCAACAGTGTAGG-3'和R1：5'-CTTT CATTGCCAGGTCCCCT-3'），扩增片段长度689 bp，委托英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1. 2. 3 PCR扩增及测序分析 对27头滇陆猪耳组织DNA样品进行PCR扩增，PCR反应体系25.0 μL，包含Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板（约50 ng）2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。扩增程序：94 ℃预变性3 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，进行40个循环;72 ℃延伸7 min，扩增产物4 ℃保存。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后送至中美泰和生物技术（北京）有限公司进行单向（正向）测序，再以DNASTAR 5.0进行序列比对分析及多态性位点检测。

1. 3 滇陆猪Nramp1基因相对表达量检测

1. 3. 1 总RNA提取及反转录 使用从天根生化科技（北京）有限公司购买的TRNzol-A+ Reagent提取27头滇陆猪组织样品中的总RNA，并参照FastQuant cDNA第一链合成试剂盒说明将以上总RNA样品反转录合成cDNA。

1. 3. 2 引物设计 以GAPDH基因作为内参基因，依据GenBank已公布的猪Nramp1基因mRNA（NM_213821.2）和GAPDH基因mRNA（NM_001206359.1）序列，利用Primer Premier 5.0设计引物（表1）。

1. 3. 3 实时荧光定量PCR扩增 对27头滇陆猪组织RNA样品进行实时荧光定量PCR扩增，反应体系20.0 μL，包含2×Super Real PreMix Plus 12.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA模板（约含100 ng）1.0 μL，ddH2O 4.5 μL。每个样品设3个重复，并设定阴性对照。扩增程序：95 ℃预变性30 s;95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，进行40个循环，并绘制熔解曲线。

1. 4 统计分析

采用Excel 2010计算目的基因多态性（SNP）位点的基因型频率、等位基因频率、杂合度（He）及多态信息含量（PIC）（表2）;使用2-△△Ct法换算目的基因在各组织中的相对表达量，并以SPSS 19.0对目的基因的组织差异表达进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 结果与分析

2. 1 滇陆猪Nramp1基因PCR扩增及序列分析结果

以滇陆猪耳组织基因组DNA为模板，用F1/R1特异引物扩增滇陆猪Nramp1基因的第5外显子、第5内含子及第6外显子等序列，扩增获得的基因片段（图1）与预期结果一致，且无非特异性条带出现，测序结果显示目的基因序列长度为689 bp。

对27份滇陆猪Nramp1基因的PCR扩增产物进行测序及序列比对分析，发现测序结果与GenBank已公布的猪Nramp1基因序列吻合，即确定为猪Nramp1基因序列。经SeqMan程序分析发现有3个多态性（SNP）位点（SNP1、SNP2和SNP3），分别位于第5外显子（T→C）、第5内含子（A→G）和第6外显子（G→A）上，且这3个SNPs位点都只存在2种基因型（图2），即SNP1位点为纯合基因型（TT）时，SNP3位点也为纯合基因型（GG）;SNP1位点为杂合基因型（TC）时，SNP3位点也为杂合基因型（GA）。

2. 2 滇陆猪Nramp1基因SNP位点的遗传分布情况

由表3可知，滇陆猪Nramp1基因SNP1、SNP2和SNP3等3个SNP位点在试验猪群體中的优势基因型分别是TT型（0.78）、AG型（0.56）和GG型（0.78），优势等位基因型分别是T（0.89）、A（0.72）和G（0.89）。进一步计算各SNPs位点的He和PIC，发现在试验滇陆猪群体中位于Nramp1基因外显子区域的SNP1和SNP3位点属于低度多态（PIC/He<0.25），而位于内含子区域的SNP2位点属于中度多态（0.25

2. 3 滇陆猪Nramp1基因在各组织中的相对表达量

对提取的所有组织样品总RNA进行检测，结果发现所有样品的总RNA浓度均在400 ng/μL以上，且OD260/OD280在1.8～2.0，说明提取获得的滇陆猪组织样品总RNA浓度和完整性均满足后续试验要求。由图3可看出，目的基因和内参基因的实时荧光定量PCR熔解曲线单一，即这2个基因的实时荧光定量PCR扩增效果良好，无引物二聚体及非特异性产物生成。

以Nramp1基因在耳缺号为025的滇陆猪心脏中的平均Ct为对照，计算Nramp1基因在滇陆猪各组织中的相对表达量。由图4可知，Nramp1基因在滇陆猪心脏、肝脏、脾脏和肺脏等组织均有表达，且在各组织间的相对表达量存在显著差异（P<0.05，下同），具体表现为肺脏>肝脏>脾脏>心脏。

2. 4 不同基因型对Nramp1基因在滇陆猪群体中表达的影响

由图5-A可知，在滇陆猪SNP1（或SNP3）位点纯合（TT或GG）群体中，Nramp1基因在肺脏中的相对表达量显著高于在心脏、肝脏和脾脏中的相对表达量，在肝脏和脾脏中的相对表达量又显著高于在心脏中的相对表达量，但在肝脏和脾脏中的相对表达量差异不显著（P>0.05，下同）;在滇陆猪SNP1（或SNP3）位点杂合群体（TC或GA）中，Nramp1基因的相对表达量也表现为肺脏>肝脏>脾脏>心脏，与纯合群体不同的是Nramp1基因在肝脏中的相对表达量显著高于在心脏和脾脏中的相对表达量，而在心脏和脾脏中的相对表达量差异不显著。由图5-B可知，在滇陆猪SNP2位点纯合群体（AA）中，Nramp1基因在各组织中的表达规律与在滇陆猪SNP1（或SNP3）位点纯合群体中的表达趋势一致;在滇陆猪SNP2位点杂合群体（AG）中，Nramp1基因在各组织间的相对表达量存在显著差异。

Nramp1基因在不同基因型滇陆猪群体间的组织差异表达情况如图6所示。由图6-A可知，在滇陆猪SNP1（或SNP3）位点各基因型群体间，Nramp1基因在纯合群体各组织中的相对表达量与在杂合群体各组织中的相对表达量均无显著差异。由图6-B可知，在滇陆猪SNP2位点各基因型群体间，Nramp1基因在纯合群体肝脏中的相对表达量显著低于在杂合群体肝脏中的相对表达量，但在2个群体其他3个组织中的相对表达量均无显著差异。

3 讨论

赵生国等（2013）研究发现，在大白猪、长白猪、杜洛克、甘肃黑猪和合作猪Nramp1基因的第2外显子和第6内含子上各存在1个SNP位点，且这2个SNPs位点与仔猪腹泻密切相关。戴超辉等（2017）研究表明，以大肠杆菌刺激猪肠道上皮细胞后Nramp1基因表达明显上调，说明Nramp1基因在大肠杆菌侵染机体的过程中发挥重要免疫调控作用。古少波等（2017）采用PCR-RFLP对八眉猪和烟台猪Nramp1基因第6内含子的NdeⅠ酶切位点进行研究，结果发现该SNP位点存在AB和BB 2种基因型，其中AB基因型是这2个猪群中的优势基因型，也是母猪群体腹泻的易感基因型。罗兴等（2017）对大白仔猪断奶前的腹泻进行研究，发现Nramp1基因第6内含子NdeⅠ酶切多态性位点AA型或AB型个体腹泻频率、腹泻指数均显著高于BB型个体。可见，Nramp1基因是与猪疾病免疫相关的重要候选基因，其多态性差异导致猪个体对疫病的免疫效力不同，可能是Nramp1基因多态性对其mRNA表达有显著影响所致（夏小慧等，2012）。

本研究对滇陆猪Nramp1基因多态性进行检测，结果在Nramp1基因的第5外显子、第5内含子和第6外显子上分别检测出SNP1（T→C）、SNP2（A→G）和SNP3（G→A）等3个SNPs位点;郑王山等（2015）对藏猪、甘肃黑猪、大白猪、约克夏猪和杜洛克猪等5个猪种的Nramp1基因进行全序列测定时发现，在Nramp1基因的第5外显子检测出A→T、C→A和G→A等3个SNPs位点，第5内含子未检测出SNP位点，第6外显子检测出1个SNP位点（G→A），说明Nramp1基因多态性还存在品种差异。本研究对滇陆猪Nramp1基因的组织差异表达进行检测，结果发现Nramp1基因在心脏、肝脏、脾脏和肺脏等组织中均有表达，与其在猪（Zhang et al.，2000）、藏猪（应三成和张义正，2007）、野交杂种猪（陈赫书和刘娣，2009）和家兔（邝良德等，2013）中的表达模式一致;Nramp1基因在滇陆猪各组织间的表达量均存在显著差异，具体表现为肺脏>肝脏>脾脏>心脏，但与其在藏猪（应三成和张义正，2007）、野交杂种猪（陈赫书和刘娣，2009）和家兔（邝良德等，2013）中的组织差异表达结果不一致，说明Nramp1基因的组织表达在不同群体或物种中存在一定差异。本研究还分析了Nramp1基因多态性变异对其在滇陆猪不同组织中表达的影响，结果表明Nramp1基因在滇陆猪不同基因型群体中表现出的组织差异表达也不同;此外，Nramp1基因在SNP2位点纯合群体肝脏中的相对表达量显著低于在杂合群体肝脏中的相对表达量，说明Nramp1基因SNP位点变异对Nramp1基因在滇陆猪组织中的表达有显著影响。因此，在今后的滇陆猪育种工作中应尽量筛选携带AG基因型的个体，以提高猪群体对疫病的免疫力。

4 结论

Nramp1基因SNP位点变异能影响Nramp1基因在滇陆猪各组织中的表达变化，从而影响机体的免疫应答反应，其中SNP2位点可作为滇陆猪抗病育种的分子标记。

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（責任编辑 兰宗宝）