曹海鹏，杨丽君，陈思佳，郭 成，杨先乐

( 1.上海海洋大学，国家水生动物病原库，上海 201306； 2.上海海洋大学，上海水产养殖工程技术研究中心， 上海 201306； 3.上海海洋大学，水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心，上海 201306； 4.上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306 )

近年来，随着水产养殖的不断发展，抗菌药在水产饲料及水产养殖中的应用也越来越广泛，有效地控制了很多水产疾病的发生，极大地促进了水产养殖业的发展，但由此也引起了致病菌耐药性增强而使抗菌药面临着疗效明显下降甚至无效等难题[1]。联合用药与合理配伍是增强抗菌药疗效、减少细菌耐药性的有效手段[2]。合理有效的联用抗菌药能增强抗菌活性，降低毒性，延缓或避免耐药菌株的产生，从而延长抗菌药的使用寿命，对致病菌的临床控制具有重要意义[2-3]。海藻希瓦菌(Shewanellaalgae)为革兰氏阴性菌，广泛分布于水产品、奶制品、水源、土壤中，为人鱼共患病的重要致病菌，危害极大。近年来，海藻希瓦菌引起的人类椎间盘炎[4]、败血症[5]以及眼斑拟石首鱼(Sciaenopsocellatus)溃疡病[6]、肾肿大症[7]、东风螺(Babylonia)吻肿病[8]、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)黑斑病[9]等病例相继被报道，对人类健康与养殖生产构成了重大的威胁。研究表明，海藻希瓦菌对硫酸庆大霉素、头孢类抗菌药高度敏感[5]，但如何对硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠进行联合使用与合理配伍却鲜有研究，这很大程度上影响了这些药物对海藻希瓦菌有效控制的稳定性。鉴于此，本试验以甲砜霉素、多西环素、噁喹酸、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑、盐酸恩诺沙星等6种渔用抗菌药[10-11]作为对照，比较测定硫酸庆大霉素、头孢噻肟钠对水产致病性海藻希瓦菌的体外抗菌作用，并在此基础上进一步评价硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠在不同复配比例下对海藻希瓦菌SFH3的体外联合抑菌效果，通过时间—杀菌曲线法测定其体外联合杀菌效果，以期为水产致病性海藻希瓦菌的控制提供联合用药与合理配伍依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

海藻希瓦菌SFH3，分离自患黑斑病的凡纳滨对虾[9]，由国家水生动物病原库提供；硫酸庆大霉素(有效含量≥98.5%，浙江先锋化工制药有限公司)；头孢噻肟钠(有效含量≥98.5%，大连容海生物科技有限公司)；甲砜霉素(有效含量≥98%，华北制药股份有限公司)；多西环素(有效含量≥98%，华北制药股份有限公司)；噁喹酸(有效含量≥98%，大连容海生物科技有限公司)；磺胺间甲氧嘧啶钠(有效含量≥98%，华北制药股份有限公司)；磺胺甲噁唑(有效含量≥98%，佛山市南海北沙制药有限公司)；盐酸恩诺沙星(有效含量≥98%，华北制药股份有限公司)。

1.2 致病性海藻希瓦菌菌悬液的制备

将斜面保藏的海藻希瓦菌SFH3在无菌条件下接种于营养琼脂斜面，32 ℃恒温培养24～48 h后，用无菌生理盐水洗下营养琼脂斜面上的菌苔，用稀释涂布平板法测定并调节菌悬液密度为5.0×108cfu/mL。

1.3 抗菌药药液的制备

参照文献[12]的方法进行抗菌药药液的制备。即准确称取各抗菌药256 mg，加入无菌蒸馏水100 mL溶解后即为质量浓度2560 mg/L抗菌药药液，经孔径为0.22 μm微孔过滤器过滤除菌，-20 ℃保存备用。

1.4 硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠对海藻希瓦菌的体外抑菌作用分析

1.4.1 硫酸庆大霉素最小抑菌质量浓度的测定

试验设3个平行，采用试管二倍稀释法[13-14]测定硫酸庆大霉素对海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌质量浓度(MIC)。即取含有2 mL无菌营养肉汤的试管13支并编号，于第1管中加入2 mL硫酸庆大霉素药液至终质量浓度为1280 mg/L，混匀后再取2 mL加入第2管中至终质量浓度为640 mg/L，依次倍比稀释直至第12管(其中2 mL弃用)，至终质量浓度分别为320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L，第13管为阳性对照，不加硫酸庆大霉素药液，然后分别接种海藻希瓦菌SFH3至终密度为5.0×105cfu/mL，于32 ℃恒温培养24 h后观察结果。以相同培养条件的空白无菌营养肉汤作为阴性对照。将肉眼观察培养液澄清透明的硫酸庆大霉素最低质量浓度作为最小抑菌质量浓度[15]。以相同试验条件下甲砜霉素、多西环素、噁喹酸、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑、盐酸恩诺沙星对海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌质量浓度作为对照。

1.4.2 头孢噻肟钠最小抑菌质量浓度的测定

试验设3个平行，采用试管二倍稀释法[13-14]测定头孢噻肟钠对海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌质量浓度。即取含有2 mL无菌营养肉汤的试管13支并编号，于第1管中加入2 mL头孢噻肟钠药液至终质量浓度为1280 mg/L，混匀后再取2 mL加入第2管中至终质量浓度为640 mg/L，依次倍比稀释直至第12管(其中2 mL弃用)，至终质量浓度分别为320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L，第13管为阳性对照，不加头孢噻肟钠药液，然后分别接种海藻希瓦菌SFH3至终密度为5.0×105cfu/mL，于32 ℃恒温培养24 h后观察结果。以相同培养条件的空白无菌营养肉汤作为阴性对照。将肉眼观察培养液澄清透明的头孢噻肟钠最低质量浓度作为最小抑菌质量浓度[15]。以相同试验条件下甲砜霉素、多西环素、噁喹酸、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑、盐酸恩诺沙星对海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌质量浓度作为对照。

1.5 硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠在不同复配比例下对海藻希瓦菌的体外联合抑菌效果分析

试验设3个平行，以不同的配比(表1)将硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠进行复配，复配后的硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠混合药物总质量为256 mg，然后参照1.3的方法制成硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠混合药液后，采用试管二倍稀释法[13-14]测定复配的硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠对海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌质量浓度，即取含有2 mL无菌营养肉汤的试管13支并编号，于第1管中加入2 mL硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠混合药液至质量浓度为1280 mg/L，混匀后再取2 mL加入第2管中至终质量浓度为640 mg/L，依次倍比稀释直至第12管(其中2 mL弃用)，分别至质量浓度为320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L，第13管为阳性对照，不加硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠混合药液，然后分别接种海藻希瓦菌SFH3至终密度5.0×105cfu/mL，于32 ℃恒温培养24 h后观察结果。以相同培养条件的空白无菌营养肉汤作为阴性对照。将肉眼观察培养液澄清透明的硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠混合药液的最低质量浓度作为最小抑菌质量浓度[15]。采用分级抑制浓度(FIC)指数对复配的硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠的联合抑菌效果进行评价。FIC指数按下式计算[16]：

FIC指数=a1/a2+b1/b2

式中，a1、a2分别为甲药联用、甲药单用时的最小抑菌质量浓度，b1、b2分别为乙药联用、乙药单用时的最小抑菌质量浓度。

FIC指数的判断标准[17]：FIC指数≤0.5，协同作用；0.5

表1 硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠的复配比例Tab.1 Mixed proportion of gentamycin sulfate and cefotaxime sodium

1.6 硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠对海藻希瓦菌的体外联合杀菌效果分析

试验设3个平行，参照文献[18]的时间—杀菌曲线法测定硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠对海藻希瓦菌SFH3的体外联合杀菌效果。即取含有5 mL无菌营养肉汤的试管5支并编号，于第1管中同时加入终质量浓度为1/2最小抑菌质量浓度的硫酸庆大霉素和终质量浓度为1/2最小抑菌质量浓度的头孢噻肟钠，于第2管中加入终质量浓度为1/2最小抑菌质量浓度的硫酸庆大霉素，于第3管中加入终质量浓度为1/2最小抑菌质量浓度的头孢噻肟钠，第4管为阴性对照，不加任何抗菌药，然后分别接种海藻希瓦菌SFH3至终密度5.0×105cfu/mL，于32 ℃恒温培养，分别在0、12、24、36、48、60、72 h取样并采用稀释涂布平板计数法测定海藻希瓦菌SFH3的密度。以培养时间为横坐标、密度的对数值为纵坐标绘制杀菌曲线。联合杀菌效果的判断标准[19]：联合用药组的菌密度对数值较药物单用组均降低超过2 log(cfu/mL)时，则判断药物联用具有协同效果；降低1～2 log(cfu/mL)时，则判断药物联用具有相加效果；降低1 log(cfu/mL)及以下时，则判断药物联用具有无相关效果。

1.7 数据处理与分析

所有试验数据采用SPSS 11.0软件进行处理分析，以平均值±标准差表示。

2 结 果

2.1 硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠对海藻希瓦菌的体外抑菌作用

试验结果表明，相对于甲砜霉素、多西环素、噁喹酸、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑、盐酸恩诺沙星等渔用抗菌药，硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠对海藻希瓦菌SFH3表现出较好的抑菌效果(表2)。其中，硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠对海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌质量浓度分别为80 mg/L和160 mg/L，而甲砜霉素、多西环素、噁喹酸、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑、盐酸恩诺沙星等抗菌药对海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌质量浓度均大于1280 mg/L。

表2 抗菌药对海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌质量浓度Tab.2 Minimum inhibitory concentration (MIC) of antimicrobials against S. algae strain SFH3

注：ND表示不确定(最小抑菌质量浓度>1280 mg/L).

Note: ND indicates uncertain (MIC>1280 mg/L).

2.2 硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠在不同复配比例下对海藻希瓦菌的体外联合抑菌效果

试验结果表明，硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠联用有利于增强对海藻希瓦菌SFH3的抑菌活性(图1)。其中，硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠对海藻希瓦菌SFH3的联合抑菌效果最佳配比为8∶2和7∶3，对海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌质量浓度均为40 mg/L，较硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠单用时对海藻希瓦菌SFH3 的最小抑菌质量浓度降低了50%和75%；其次的配比为9∶1和6∶4，对海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌质量浓度为53 mg/L，较硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠单用时对海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌质量浓度降低了34%和67%；再次的配比是4∶6和3∶7，对海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌质量浓度为67 mg/L，较硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠单用时对海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌质量浓度降低了16%和58%。此外，测定了硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠在不同的复配比例下的FIC指数(表3)，硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠按8∶2、7∶3比例进行复配时，FIC指数小于0.5，对海藻希瓦菌SFH3的体外抑菌作用表现为协同作用；硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠按9∶1、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9比例进行复配时，FIC指数为0.5～1，对海藻希瓦菌SFH3的体外抑菌作用则表现为相加作用。

图1 不同复配比例的硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠 对海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌质量浓度Fig.1 Minimum inhibitory concentration (MIC) of the combined use of gentamycin sulfate and cefotaxime sodium at different mixed proportions

表3 硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠联用的FIC指数Tab.3 Fractional inhibitory concentration (FIC) index of the combined use of gentamycin sulfate and cefotaxime sodium

2.3 硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠对海藻希瓦菌的体外联合杀菌效果

硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠对海藻希瓦菌SFH3的时间—杀菌曲线见图2。试验结果表明，不添加任何抗菌药的阴性对照组中，海藻希瓦菌SFH3的密度在培养72 h后较初始值增加了2.95 log(cfu/mL)，相同条件下仅添加40 mg/L(1/2最小抑菌质量浓度)硫酸庆大霉素的试验组中，海藻希瓦菌SFH3的密度较初始值增加了1.51 log(cfu/mL)，仅添加80 mg/L(1/2最小抑菌质量浓度)头孢噻肟钠的试验组中，海藻希瓦菌SFH3的密度较初始值降低了0.24 log(cfu/mL)，而同时添加40 mg/L(1/2最小抑菌质量浓度)硫酸庆大霉素和80 mg/L(1/2最小抑菌质量浓度)头孢噻肟钠的试验组中海藻希瓦菌SFH3的密度降低了1.78 log(cfu/mL)，分别较添加40 mg/L(1/2最小抑菌质量浓度)硫酸庆大霉素的试验组和80 mg/L(1/2最小抑菌质量浓度)头孢噻肟钠的试验组降低了3.29 log(cfu/mL)和2.02 log(cfu/mL)，说明40 mg/L硫酸庆大霉素和80 mg/L头孢噻肟钠对海藻希瓦菌SFH3的体外联合杀菌作用具有协同效果。

图2 硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠对海藻希瓦菌SFH3的 时间—杀菌曲线Fig.2 Time-killing curve of gentamycin sulfate and cefotaxime sodium against S. algae strain SFH3

3 讨 论

3.1 致病性海藻希瓦菌潜在控制药物研究应给予重视

人鱼共患致病菌作为引发食源性疾病的重要因素，严重威胁人类的健康。2012年上海闵行区曾发生了上百起因水产品中副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)污染引起的腹泻[20]。因此，研究人鱼共患致病菌对预防和控制食源性疾病具有重要的现实意义。目前，嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、副溶血弧菌、霍乱弧菌(V.cholerae)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)等人鱼共患致病菌已经引起研究者的高度重视，并开展了相应的药物控制技术研究工作[21-26]，但作为人鱼共患致病菌的海藻希瓦菌的药物控制技术研究却鲜见详细报道。因此，笔者研究了硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠对水产致病性海藻希瓦菌SFH3的体外联合抗菌效果，旨在为致病性海藻希瓦菌的潜在控制药物提供理论参考。

3.2 硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠对海藻希瓦菌体外抑菌效果分析方法的选择

抗菌药体外抑菌效果的分析方法主要包括试管二倍稀释法[13]、药敏纸片法[27]、平皿二倍稀释法[28]和微孔板稀释法[29]等。其中，试管二倍稀释法是一种精确定量的方法，不仅能够直接测定抗菌药对病原菌的最小抑菌质量浓度，而且还能间接比较抗菌药的抑菌效果，以及病原菌对抗菌药耐药性产生的速度，更为直观、可靠[30]。郝贵杰等[31]通过试管二倍稀释法测定了甲砜霉素、恩诺沙星预混剂等抗菌药制剂对大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)致病性哈维氏弧菌(V.harveyi)的体外抑菌活性；樊海平等[32]通过试管二倍稀释法测定了盐酸恩诺沙星、米诺沙星、氟苯尼考等抗菌药对霍乱弧菌、鳗弧菌(V.anguillarum)、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌(A.caviae)、温和气单胞菌(A.sobria)、迟钝爱德华氏菌的体外抑菌效果。因此，本试验选用试管二倍稀释法测定了硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠对海藻希瓦菌SFH3的体外抑菌活性。本试验发现，相对于甲砜霉素、多西环素、噁喹酸、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑、盐酸恩诺沙星等渔用抗菌药，硫酸庆大霉素与头孢噻肟钠对海藻希瓦菌SFH3具有良好的抑菌活性，这与张继挺等[7]研究观点一致。

3.3 硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠对海藻希瓦菌体外联合抗菌效果分析

迄今为止，农业农村部批准使用的渔药多为直接由兽药移用而来[33]。因此，评价兽用抗菌药对水产致病菌的体外抗菌效果对渔药的开发具有重要的意义。硫酸庆大霉素为兽用氨基糖甙类广谱抗菌药，通过与细菌核糖蛋白体亚单位上的特异性蛋白牢固结合，干扰核糖蛋白体功能，阻止蛋白质合成，并引起mRNA上密码的错误合成无功能蛋白质，对多种革兰氏阴性菌及阳性菌均有抑菌和杀菌作用，对虾红腿病、烂鳃病、甲壳溃疡病等细菌性疾病具有潜在的治疗效果[11,34]。头孢噻肟钠为第三代兽用半合成头孢菌素，通过与细菌细胞膜上某些酶结合，改变细菌细胞膜的通透性，并释放自溶素，达到抑菌的效果，因而抗菌谱较第一、二代头孢菌素更广[35]。目前，头孢噻肟钠与磷霉素钙联用、头孢噻肟钠与亚胺培南联用的协同抗菌效果已经得到了证实[36-37]，但据现有文献资料，硫酸庆大霉素与头孢噻肟钠联用对水产致病菌的体外联合抗菌作用却鲜有详细报道。本试验结果表明，硫酸庆大霉素和头孢噻肟钠的联用在不同复配比例下能够显著增强对海藻希瓦菌SFH3的体外抑菌活性，表现为协同效应和相加效应，这与文献[38]研究发现的两种杀菌剂在不同复配比例下抗菌效应不同的结论一致。究其原因，可能是硫酸庆大霉素属于静止期杀菌剂，能够迅速抑制海藻希瓦菌SFH3蛋白质的合成，使其处于静止状态，与作为繁殖期杀菌剂的头孢噻肟钠联用，促进头孢噻肟钠充分发挥其改变细胞膜通透性和释放自溶素的作用，从而增加了对海藻希瓦菌SFH3的体外抗菌活性，产生了协同作用和相加作用[34-35,39]。此外，40 mg/L硫酸庆大霉素和80 mg/L头孢噻肟钠对海藻希瓦菌SFH3的体外联合杀菌作用也具有协同效果，这可能是因为头孢噻肟钠破坏菌体细胞壁的完整性，有利于硫酸庆大霉素进入菌体内与核糖蛋白体亚单位上的特异性蛋白牢固结合，干扰核糖蛋白体功能，最终导致菌体死亡[34,40]。