程 敏，李忠琴，翟少伟，赖晓健，杨求华，江兴龙

( 1.集美大学 水产学院，福建 厦门 361021； 2.鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建 厦门 361021； 3.厦门市渔用药物工程技术研究中心，福建 厦门 361021； 4.福建省水产研究所，福建 厦门 361021 )

随着科技的发展与生活质量的提高，水产养殖持续发展，水产养殖规模不断扩大。环境污染和全球变暖等问题的出现，使水产动物病害的潜在风险受到广大研究者的关注。许多中草药都具有提高生物机体的非特异性免疫力的作用，如提高白细胞呼吸爆发活性和吞噬活性，进而能够增强生物体抵抗病原侵害的能力，能够有效的预防疾病的发生，而且中草药属于绿色天然植物，具有污染小、来源丰富、功能多样等优点，同时中草药如连翘、黄芪、黄连等对于增强动物体免疫能力亦具有突出作用[1-2]。中草药在水产养殖病害防控中具有广泛应用前景，如孟彬等[3]的试验结果显示，发酵中草药在水产养殖中具有明显优势；中草药添加剂提高了水产品的质量，减少了化学药物残留[4-6]。因此，中草药添加剂备受水产养殖业者的关注。笔者以尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)为研究对象，采用尼罗罗非鱼离体外周血白细胞与中草药提取液共孵育的方法，检测共孵育后中草药提取液对白细胞呼吸爆发活性和吞噬活性的影响，考察多种中草药对尼罗罗非鱼免疫细胞激活效果，筛选出适合尼罗罗非鱼养殖使用的天然免疫增强剂[7-11]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

尼罗罗非鱼：试验鱼均为养殖场养殖14 d以上的尼罗罗非鱼。

中草药：五倍子、白头翁、地榆、柯子、虎杖。

仪器：酶标仪(MULTISKAN GO、Thermo SCIENTIFIC)、流式细胞仪(CytoFLEX、贝克曼库尔特)、超微粉碎机(SQW-601山东三清不锈钢设备有限公司)、生化培养箱(LRH-250、上海一恒科技学仪器有限公司)等。

1.2 试验方法

1.2.1 主要试验试剂及配制方法

Percoll细胞分离液、二甲基亚砜分析纯、台盼蓝染液、L-15细胞培养液。

磷酸缓冲盐溶液：用蒸馏水依次稀释Na2HPO41.07 g，KH2PO40.398 g和NaCl 8.5 g，偶用稀盐酸溶液调节pH至7.2～7.4，然后用容量瓶定容至1000 mL，分装后放置高压灭菌锅中，121 ℃下，高温高压灭菌20 min，灭菌结束后放置于冰箱中4 ℃保存。

抗凝剂：用已灭菌的磷酸缓冲盐溶液将肝素钠稀释成3000 U/mL，用0.2 μm过滤器过滤后，置于4 ℃冰箱中保存。

0.2% NBT：将20 mg NBT加入10 mL已经灭菌的磷酸缓冲盐溶液中溶解，置于冰箱中4 ℃避光保存。

2 mol KOH:用已灭菌的去离子水稀释11.2 g KOH固体，然后用容量瓶定容至100 mL，置于冰箱中4 ℃保存。

70%甲醇水溶液：用灭菌的去离子水稀释，70 mL甲醇加入30 mL灭菌的去离子水中，置于冰箱中4 ℃保存。

5%二甲基亚砜溶液：用灭菌的磷酸缓冲盐溶液配制,5 mL二甲基亚砜加入95 mL磷酸缓冲盐溶液，置于冰箱4 ℃保存。

荧光微球悬液的制备：将标准微球悬液用灭菌的磷酸缓冲盐溶液稀释成密度为1×105个/mL的微球悬液。

70%乙醇溶液：用蒸馏水与95%的乙醇混合制备。

1.2.2 中草药提取液的制备[12]

中药的超微粉碎：将所选的中草药用中药粉碎机粉碎至约100目，将粉碎的药粉放入超微粉碎机进一步粉碎后，收集超微药粉备用。

中草药提取物样品制备：将收集的超微药粉过160目筛后，收集药粉，按照料液比1∶10的比例将药粉与60%的乙醇水溶液混合，用超声波粉碎机超声1 h，用滤纸过滤后收集滤液，将滤液置于多样品平行蒸发仪中浓缩后制得中药提取物，将中药提取物置于4 ℃环境下保存。

称取1.00 g的单味中草药提取物，置于15 mL离心管，加10 mL 5%二甲基亚砜溶液后混匀。在恒温振荡仪中浸泡提取72 h，用离心机2500 r/min下离心10 min，用0.2 μm的无菌滤膜过滤上清液，制成质量浓度为0.1 mg/mL的药液。依照此方法制备不同质量浓度梯度试验药液。

1.2.3 双联用药液配制

依据5种中草药提取液的最低抑菌质量浓度(MIC)[13]，分别将两种中草药的药液等体积混合，药液质量浓度配比见表1，依照中草药单用方法进行操作。其中药物组合(A+B)分别为：Ⅰ，五倍子+白头翁；Ⅱ，五倍子+地榆；Ⅲ，五倍子+柯子；Ⅳ，五倍子+虎杖；Ⅴ，白头翁+地榆；Ⅵ，白头翁+柯子；Ⅶ，白头翁+虎杖；Ⅷ，地榆+柯子；Ⅸ，地榆+虎杖；Ⅹ，柯子+虎杖。

表1 中草药双联用质量浓度配比Tab.1 Concentration proportion of Chinese herbal medicine for dual-prescription

1.2.4 尼罗罗非鱼血浆的制备[14]

取经14 d暂养的尼罗罗非鱼，在1 L水体加入0.05 mL丁香酚进行麻醉，用无菌注射器吸取0.2 mL抗凝剂，自鱼尾静脉采血0.5 mL,将鱼血与L-15细胞培养基按体积比1∶9的比例混合，制成尼罗罗非鱼血浆。

1.2.5 外周血白细胞的分离制备[15-16]

将无菌生理盐水和Percoll细胞分离液按照不同的比例混合，制成70%、60%、50%、40%、30%的细胞分离混合液。每种比例的混合液设3个平行组，选择最合适的Percoll细胞分离混合液分离制备尼罗罗非鱼白细胞样品。

1.2.6 尼罗罗非鱼外周血白细胞呼吸爆发试验[17]

取一块96微孔板，将每一行设为一组，1～3孔为L组，4～6孔为N组，第一行为空白对照组，其余各行为中草药提取液试验组。(1)每孔加入白细胞悬液100 μL。(2)试验组每孔加入100 μL的中草药提取液，空白对照组每孔加入100 μL的5%二甲基亚砜溶液，然后用磷酸缓冲盐溶液将每孔补齐到300 μL。在室温下孵育2 h，然后将每孔的上清液吸去100 μL，再用100 μL的L-15细胞培养基洗涤3次。(3)向每行的1～3孔加入50 μL的L-15细胞培养基，每行的4～6孔各加入50 μL的L-15细胞培养液和0.2% NBT溶液，再用磷酸缓冲盐溶液将每孔补齐到300 μL。置于室温下孵育1 h，然后将每孔的上清液吸去100 μL，再加入100 μL的甲醇固定3 min，然后再去除100 μL的上清液，再用100 μL的70%甲醇溶液清洗3次。接着轻轻的吹去每孔的液体，在室温下风干后，在每孔中加入100 μL的2 mol KOH溶液和200 μL 100%二甲基亚砜，然后用全波长酶标仪测定波长630 nm下各孔的吸光值(OD)。

1.2.7 尼罗罗非鱼外周血白细胞吞噬试验[18-19]

试验组：将200 μL白细胞悬液分装于已灭菌的1.5 mL离心管中，加入100 μL中草药提取液，常温下共孵育2 h，之后加入50 μL微球悬液，混匀后常温下避光反应，1 h后加入250 μL 70%甲醇固定，终止反应，然后依次进样，采用流式细胞仪检测。

对照组：将200 μL白细胞悬液分装于已灭菌的1.5 mL离心管中，加入100 μL 5%二甲基亚砜，常温下共孵育2 h，之后加入50 μL微球悬液，混匀后常温下避光反应，1 h后加入250 μL 70%甲醇固定，终止反应，然后依次进样，采用流式细胞仪检测。

1.2.8 白细胞呼吸爆发及吞噬率的计算公式

呼吸爆发活性=ODN-ODL

呼吸爆发增加率/%=(m1-m)/m×100%

细胞吞噬率/%=n1/n×100%

细胞吞噬增加率/%=(f1-f)/f×100%

呼吸爆发联用指数=[(A2-A1)+(B2-B1)]/(A1+B1)

吞噬联用指数=[(A4-A3)+(B4-B3)]/(A3+B3)

式中，ODN为N孔的吸光值，ODL为L孔的吸光值；m1为试验组呼吸爆发活性，m为空白对照组呼吸爆发活性；n1为参与吞噬的细胞数，n为血细胞总数；f1为试验组细胞吞噬率，f为对照组细胞吞噬率；A1为A药单用呼吸爆发增加率，A2为A药联用呼吸爆发增加率，B1为B药单用呼吸爆发增加率，B2为B药联用呼吸爆发增加率；A3为A药单用吞噬增加率，A4为A药联用吞噬增加率，B3为B药单用吞噬增加率，B4为B药联用吞噬增加率。

2 结果与分析

2.1 外周血白细胞分离液的比例优化

因为白细胞分离试验是后续试验的铺垫，要求其有较高的准确性，所以对于这个部分的试验进行了多次重复，以确定准确性，对不同比例的Percoll细胞分离混合液的分离效果的研究表明，30%的Percoll细胞分离混合液分离的效果最好，获得的白细胞密度最高，密度达107cfu/mL(表2)。

表2 外周血白细胞的分离液比例优化Tab.2 Proportion optimization of leukocytes and percoll cell separation mixture

2.2 外周血白细胞呼吸爆发活性的测定

2.2.1 5味中草药单用对白细胞呼吸爆发活性的影响

5味中草药提取液与尼罗罗非鱼外周血白细胞共孵育的研究结果显示，当五倍子、白头翁、地榆、柯子、虎杖的质量浓度分别为0.5、50、1.5、1.5、2.0 mg/mL时，白细胞呼吸爆发活性值最高，其白细胞呼吸爆发活性增加率分别为128.68%、123.96%、28.37%、44.44%、78.93%。由试验结果可知，以上几味中草药提取液的白细胞呼吸爆发活性值均显著高于其对照组，表明这5味中草药均可显著提高尼罗罗非鱼外周血白细胞的呼吸爆发活性。单用组间差异分析得出白细胞呼吸爆发活性在五倍子与柯子，虎杖与柯子具有显著性；呼吸爆发活性增加率在五倍子与地榆、五倍子与柯子、五倍子与虎杖、白头翁与地榆、白头翁与柯子、白头翁与虎杖具有显著性(图1、2)。

图1 5味中草药提取物单用的白细胞呼吸爆发活性Fig.1 Respiratory burst activity leukocytes of during treatement with five Chinese herbal extracts

图2 5味中草药提取物单用的白细胞呼吸爆发活性增加率Fig.2 Increase rate in respiratory burst activity in leukocytes during treatment with five Chinese herbal extracts不同字母表示具有显著性差异，相同字母表示无显著性差异，下同.Means with different letters are significant difference, and means with same letter are not significant difference, et sequentia.

2.2.2 5味中草药双联用对白细胞呼吸爆发活性的影响

根据尼罗罗非鱼外周血白细胞呼吸爆发试验单用的结果，将上述中草药提取液进行双联用(最低抑菌质量浓度)，试验结果显示，当五倍子∶白头翁的质量浓度比例为2.0∶2.0、五倍子∶地榆的质量浓度比例为0.5∶2.0、五倍子∶柯子的质量浓度比例为0.5∶1.0、五倍子∶虎杖的质量浓度比例为2.0∶0.5、白头翁∶地榆的质量浓度比例为2.0∶2.0、白头翁∶柯子的质量浓度比例为2.0∶2.0、白头翁∶虎杖的质量浓度比例为0.5∶1.0、地榆∶柯子的质量浓度比例为2.0∶2.0、地榆∶虎杖的质量浓度比例为1.0∶2.0、柯子∶虎杖的质量浓度比例为0.5∶1.0时，白细胞呼吸爆发活性最高，其呼吸爆发活性增加率分别为138.93%、108.53%、58.70%、64.29%、106.55%、79.85%、115.17%、84.15%、63.76%、79.01%。呼吸双联用各组间显著性分析得出，质量浓度对白细胞免疫活性的作用的影响较小，不同中药对白细胞免疫活性的作用的影响较大，差异显著(表3、图3)。

表3 中草药提取物双联用的白细胞呼吸爆发活性增加率 %Tab.3 The increase rate in respiratory burst activity in leukocytes during treatment with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

尼罗罗非鱼外周血白细胞呼吸爆发试验单用与双联用试验中白头翁+地榆、白头翁+柯子、白头翁+虎杖、地榆+柯子、柯子+虎杖5组的联用指数分别为1.28、0.10、0.51、0.54、0.02，其中，白头翁+地榆表现出其显著的协同作用(表4、图4)。

2.3 外周血白细胞吞噬活性的分析

2.3.1 5味中草药单用对白细胞吞噬活性的影响

对上述筛选的单独使用可显著提高尼罗罗非鱼外周血白细胞呼吸爆发活性的5味中草药，进一步测定其对外周血白细胞吞噬活性的影响，再采用流式细胞仪技术检测白细胞吞噬率。试验结果表明，当五倍子、白头翁、地榆、柯子、虎杖的质量浓度分别为0.125、25.0、1.5、1.5、0.5 mg/mL、时，均能显著提高尼罗罗非鱼外周血白细胞的吞噬活性(图5)，吞噬率较对照组分别增加了44.04%、44.66%、95.00%、10.35%、64.93%，之后随地榆、柯子、五倍子、虎杖4种中草药的质量浓度增加，吞噬率下降，甚至出现抑制；而当白头翁质量浓度增加时，吞噬率趋于平稳。而组间的吞噬效果没有明显差异。

图3 双联用呼吸爆发活性增加率及显著性分析Fig.3 The increase rate and significance of respiratory burst activity in leukocytes during treatment with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

表45味中草药双联用的呼吸爆发联用指数

Tab.4 Combination index of respiratory burst index during treatment with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

图4 5味中草药单用和双联用呼吸爆发增加率对比Fig.4 Comparison of increase rate in respiratory burst activity in leukocytes between treatment with single and dual-prescription of five Chinese herbal extracts

2.3.2 5味中草药双联用对白细胞吞噬活性的影响

依照尼罗罗非鱼外周血白细胞吞噬活性试验单用的结果，将上述中草药提取液进行双联用，试验结果显示，当五倍子∶白头翁的质量浓度比例为0.5∶1.0、五倍子∶地榆的质量浓度比例为0.5∶1.0、五倍子∶柯子的质量浓度比例为0.5∶1.0、五倍子∶虎杖的质量浓度比例为0.5∶0.5、白头翁∶地榆的质量浓度比例为2.0∶1.0、白头翁∶柯子的质量浓度比例为2.0∶1.0、白头翁∶虎杖的质量浓度比例为2.0∶1.0、地榆∶柯子的质量浓度比例为1.0∶1.0、地榆∶虎杖的质量浓度比例为0.5∶0.5、柯子∶虎杖的质量浓度比例为1.0∶0.5时，吞噬增加率最高，分别为45.96%、58.53%、38.83%、23.84%、59.48%、62.85%、92.27%、59.70%、86.27%、69.22%。吞噬双联用各组间显著性分析得出，质量浓度对白细胞吞噬增加率的作用的影响较小，不同中药对白细胞吞噬增加率作用的影响较大，差异显著(表5、图6)。

图5 白细胞与中药共孵育后吞噬活性增加率Fig.5 Increase rate in phagocytic activity in leukocytes treated with five Chinese herbal extracts

尼罗罗非鱼外周血白细胞吞噬活性单用与双联用试验中，五倍子+白头翁、五倍子+柯子、五倍子+虎杖、白头翁+柯子、白头翁+虎杖、地榆+柯子、地榆+虎杖、柯子+虎杖8组的细胞吞噬联用指数分别是0.90、0.78、3.03、1.06、11.45、0.13、0.28、6.20，其中五倍子+虎杖、白头翁+柯子、白头翁+虎杖、柯子+虎杖表现出显著的协同作用(表6、图7)。

表5 5味中草药双联用的白细胞吞噬力增加率 %Tab.5 Increase rate in phagocytosis in leukocytes treated with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

图6 5味中草药双联用的白细胞吞噬力比较Fig.6 Comparison of phagocytosis in leukocytes treated with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

表6 五味中草药双联用的吞噬联用指数Tab.6 Combination of phagocytosis index during treatment with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

3 讨 论

3.1 细胞分离液对外周血白细胞分离效果的影响

不同品种的鱼类，其血细胞的构成和血液指数也会不同，因此，对于不同品种的鱼，Percoll细胞分离混合液分离的条件也会不同。已有研究发现，当

图7 5味中草药单用和双联用吞噬增加率对比Fig.7 Comparison of the increase rate of phagocytic activity in leukocytes treated with single and dual-prescription of five Chinese herbal extracts

分离液的密度为1.080～1.085时，可将草鱼(Ctenopharyngodonidellus)和鲤鱼(Cyprinuscarpio)外周血白细胞有效的分离出来[20]，本试验研究结果表明，30%的Percoll细胞分离混合液的分离效果最好，与草鱼和鲤鱼的细胞分离液密度较为接近[21]。

3.2 白细胞吞噬活性测定方法的建立

经过对比几种测定白细胞吞噬的方法发现，流式细胞仪技术相对于传统的技术而言，具有显著的优势，如测定的准确性高、重复性好且操作简单。显微镜镜检法通过对细胞的染色，可直接用肉眼在显微镜下观察细胞的形态特征及细胞吞噬现象。通过这种方法也确实获得了许多关于细胞形态及功能的信息，但是镜检法也存在许多缺点，如重复性差和主观性强等问题。而相比较而言，流式细胞仪技术就能很好地解决这种主观性问题,不仅测定准确性高、重复性好且操作简单快捷，因此本试验最终以流式细胞仪技术为检测方法[22]。

3.3 中草药增强白细胞免疫活性的分析

随着水产养殖的持续发展，人们已经将水产病害防治研究的目光转向了中草药这种即安全又高效的药物。本研究以尼罗罗非鱼为对象，结合5味中草药的提取液，再利用氮蓝四唑还原法和流式细胞仪技术分别检测这5味中草药提取液对尼罗罗非鱼血清免疫细胞的影响，初步筛选出能够提高尼罗罗非鱼非特异性免疫能力的中草药免疫增强剂。通过对以上5种中草药两两联用后，在氧呼吸爆发双联用试验中，表现出协同作用的有白头翁+地榆、地榆+柯子、白头翁+虎杖，在吞噬双联用试验中，表现出协同作用的有五倍子+白头翁、白头翁+虎杖、柯子+虎杖。

相比较本试验的方法而言，以往的研究主要是采用拌料投喂的方式进行，这种方式不仅耗时久，而且不适合快速筛选大量的样品[23]。而本试验采用离体外周血白细胞与中草药提取液共孵育的方法，快速检测这5味中草药对尼罗罗非鱼血清免疫细胞的影响，这种方法具有筛选成本低，筛选速度快等优点，而且很适合对大量的样品进行快速筛选[24]。

4 结 论

通过建立离体尼罗罗非鱼外周血白细胞与中草药提取液共孵育的方法，再结合流式细胞仪技术对白细胞呼吸爆发活性和吞噬活性的影响进行检测，单用试验结果显示，五倍子、白头翁、地榆、柯子和虎杖5味中草药均能显著增强尼罗罗非鱼外周血白细胞的呼吸爆发活性和吞噬活性。呼吸爆发活性试验结果显示，在最适的质量浓度下，5味中草药提取液的白细胞呼吸爆发活性值均显著高于其对照组，均可以显著提高尼罗罗非鱼外周血白细胞的呼吸爆发活性，其呼吸爆发活性增加率为五倍子>白头翁>虎杖>柯子>地榆。吞噬活性试验结果显示，在最适质量浓度下，5味中草药吞噬率均优于对照组，其提高吞噬率效果为地榆>虎杖>白头翁>五倍子>柯子。

5味中草药双联用的研究结果表明，在呼吸爆发活性双联用试验组合中表现明显协同作用，且活性为白头翁+地榆>白头翁+虎杖；在吞噬活性双联用试验组合中表现明显协同作用，且活性为白头翁+虎杖>柯子+虎杖>五倍子+虎杖>白头翁+柯子。

综合呼吸爆发活性和吞噬活性的试验结果，可白头翁+虎杖选择组合开发成渔药，能显著提高养殖尼罗罗非鱼血浆白细胞免疫活性，进而提高其抗病力。本研究可为此5味中草药在水产养殖防病上的应用提供科学理论依据。