微流控芯片非接触电导法快速测定盐酸美金刚片中盐酸美金刚的含量

2020-03-19李智磊李静岚陈缵光王宇航胡姗姗杨秀娟

分析测试学报 2020年2期

李智磊，李静岚，陈缵光，王宇航，胡姗姗，杨秀娟*，王勇*

(1.南方医科大学珠江医院药学部，广东广州 510280；2.深圳市第二人民医院药学部，广东深圳 518035；3.中山大学药学院，广东广州 510006)

盐酸美金刚是一种非竞争性、电压依赖性的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体抑制剂，是临床治疗中至重度阿尔茨海默病的主要药物，具有降低β-淀粉样蛋白毒性，减少小胶质细胞相关炎症，增加星形胶质细胞的神经营养因子释放等作用[1]。盐酸美金刚的含量测定对药品质量控制、生物医学研究等具有重要意义。

由于盐酸美金刚具有溶解度小、无紫外吸收等特性，因而无法以常用的高效液相色谱-紫外检测器检测[2]。目前，文献报道的盐酸美金刚含量测定方法主要有高效液相色谱-示差折光检测法[2]、柱前衍生高效液相色谱法[3]、气相色谱法[4]、酸性染料比色法[5]、激光诱导荧光检测法[6]等。但高效液相色谱-示差折光检测法的分析成本较高，试剂消耗量较大；气相色谱法的分析成本也较高，分析时间较长；酸性染料比色法需药物与额外的酸性染料络合；激光诱导荧光检测法与柱前衍生高效液相色谱法均需化学衍生化处理。因此，目前亟需一种成本低、试剂消耗少、方法简单、检测快速的盐酸美金刚检测方法。

微流控芯片是将反应、分离、检测等集成于微芯片上的一种新技术，具有分析速度快、样品处理简单、重复性好、成本低等优点[7]，已应用于药物与细胞相互作用、食品安全分析、临床检测、药物筛选等多种领域[8-11]。其中，微流控芯片非接触电导法是微流控芯片技术主流的检测方法之一，在药物分析方面具有较多应用[12-16]，适用于需要快速化、便携化、低成本测试的场景，但未见将该方法应用于盐酸美金刚测定的文献报道。根据药品标准查询数据库[17]，包括2015版中国药典、部颁化学药品与制剂等多种质量标准数据库，均无盐酸美金刚相关的国家及地方的质量检测标准。因此本研究采用微流控芯片非接触电导法建立了快速测定盐酸美金刚片中盐酸美金刚含量的方法，以期为盐酸美金刚的现场质量控制及质量检测标准建立提供参考，同时也为盐酸美金刚的医药学研究提供了一种新型的快速检测方法。

图1 微流控芯片及非接触电导分析仪的结构图

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

μD-CCD/HV-2014型微流控芯片非接触电导分析仪，包括高压电源、非接触电导检测器和色谱工作站(中山大学药学院研制);聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)十字通道芯片(大连理工大学微系统研究中心，微通道上宽30 μm，下宽100 μm，深30 μm);微流控芯片非接触电导分析仪与芯片结构见图1；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵(巩仪市英峪予华仪器厂)；ME4001型十万分之一电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

盐酸美金刚片(联邦制药股份有限公司，批号：81216202、90216201、90316262，规格：10 mg/片)；盐酸美金刚对照品(北京索莱宝科技有限公司，批号：109A022，纯度≥98%)；三乙胺(上海阿拉丁试剂有限公司)、磷酸(天津市大茂化学试剂厂)均为色谱纯，其余试剂均为分析纯；实验用水为双蒸水。

1.2 检测条件

缓冲溶液：含有2%(体积分数)二甲基亚砜(DMSO)的3.0 mmol/L三乙胺-2.0 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 3.3)；进样时间：10 s；分离电压：2.0 kV；根据前期工作[18]，非接触电导检测器的激发电压：60 V，激发频率：60 kHz。实验在恒温(20 ℃)、恒湿(60%)条件下进行。

1.3 实验方法

1.3.1 仪器使用方法首先，使芯片上所有储液池和通道充满缓冲溶液，吸除样品池中的缓冲溶液，在样品池中加入样品溶液。然后，在进样通道两端加上进样电压，进行进样；进样完毕后，在分离通道两端加上分离电压，进行分离。样品通过检测器被检测，得到待测样品的检测分离图谱。

1.3.2 供试品溶液的制备取盐酸美金刚片20片在研钵中研细，精密称取2.104 0 g(约含盐酸美金刚100 mg)，置于50 mL容量瓶中，加入缓冲溶液定容，超声6 min后，得盐酸美金刚质量浓度约为2 mg/mL的供试品贮备液，于4 ℃下保存备用，临用前加入缓冲溶液稀释至所需浓度。

1.3.3 对照品溶液的制备精密称取盐酸美金刚对照品0.020 0 g，置于10 mL容量瓶中，加入缓冲溶液溶解并定容，超声6 min后，得盐酸美金刚质量浓度为2 mg/mL的对照品贮备液，于4 ℃下保存备用，临用前加入缓冲溶液稀释至所需浓度。

2 结果与讨论

2.1 DMSO体积分数的优化

由于盐酸美金刚在水中溶解度差，根据相似相溶原理，加入助溶剂DMSO改变溶液极性可增加盐酸美金刚的溶解度。实验对DMSO的体积分数(0.5%、1%、1.5%、2%、3%)进行了优化。结果显示，2%的DMSO溶液可以完全溶解2 mg/mL盐酸美金刚。因此，选择DMSO的体积分数为2%。

2.2 缓冲溶液种类的优化

考察了对照品溶液(200 μg/mL)在含有2% DMSO的硼酸-硼砂、2-(N-吗啡啉)乙磺酸-组氨酸(MES-His)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸-三羟甲基氨基甲烷(MES-Tris)、Tris-磷酸、Tris-柠檬酸、Tris-硼酸、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、乙酸-乙酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、三乙胺-硼酸、三乙胺-磷酸等缓冲体系的出峰情况。结果显示：在含2% DMSO的三乙胺-磷酸缓冲体系中盐酸美金刚有峰响应，且基线平稳,噪音低，峰形较好，出峰时间最短。在其他体系中不出峰，一方面可能与缓冲体系背景电导率与样品解离的电导率相差不大有关，另一方面可能由于缓冲体系的pH值不适于样品解离出峰。因此，选择含有2% DMSO的三乙胺-磷酸作为缓冲溶液。

2.3 缓冲溶液浓度的优化

考察了三乙胺-磷酸的浓度对盐酸美金刚分离效果的影响，分别测试了含有2% DMSO的2.5 mmol/L三乙胺-2.5 mmol/L磷酸缓冲溶液、5.0 mmol/L三乙胺-5.0 mmol/L磷酸缓冲溶液、10.0 mmol/L三乙胺-10.0 mmol/L磷酸缓冲溶液、20.0 mmol/L三乙胺-20.0 mmol/L磷酸缓冲溶液。结果发现，随着浓度的增大，基线噪音也随之增大，且盐酸美金刚出峰不明显，因此最终选择缓冲对离子总浓度为5.0 mmol/L。

2.4 缓冲溶液pH值的优化

考察了缓冲体系(均含2% DMSO)pH值对出峰的影响。如图2所示，盐酸美金刚在2.0 mmol/L三乙胺-3.0 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 2.9)中出峰情况较差，峰形为三峰；在2.5 mmol/L三乙胺-2.5 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 3.2)中的出峰情况稍有改善，但峰形为双峰；在3.0 mmol/L三乙胺-2.0 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 3.3)中峰形良好，为单峰，且基线噪音较低；在4.0 mmol/L三乙胺-1.0 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.7)中的基线噪音低，但峰展宽，峰形较差。

上述结果表明，随着pH值增加以及三乙胺浓度的增大，盐酸美金刚的峰形由多峰变为单峰。但pH值过大、磷酸浓度过小会出现单峰峰展宽、出峰时间延后等现象，这可能与三乙胺-磷酸相对浓度改变导致缓冲溶液极性变化以及与缓冲溶液pH值有关。因此，最终选择含2% DMSO的3.0 mmol/L三乙胺-2.0 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 3.3)作为运行缓冲体系。

2.5 进样时间的优化

考察了进样时间在5～20 s范围内对样品分离和检测的影响。结果显示，随着进样时间的延长，峰形及体系噪音等未发生明显变化，而样品由于进样时间增加，进样量增大，导致检测峰信号的响应值增大，但随着进样时间的增加,峰展宽和峰形拖尾等影响变得显著。综合考虑，最终选择进样时间为10 s。

2.6 分离电压的优化

考察了分离电压在1.0～3.0 kV范围内对样品分离和检测的影响。结果发现，较低的分离电压会使样品的出峰时间延长，且可能出现拖尾现象；而分离电压过高时，电流增大，因焦耳热效应，基线噪音也随之增加，导致信噪比下降。综合考虑峰形、响应值、噪音等因素，选择最佳分离电压为2.0 kV。

图2 盐酸美金刚在含2% DMSO的不同pH值的三乙胺-磷酸缓冲体系下的微流控芯片电泳色谱图

2.7 方法学考察

2.7.1 线性关系、检出限与定量下限按“1.3.3”方法配制质量浓度分别为10、50、100、200、400、600、800、1 000、2 000 μg/mL的系列对照品溶液，按“1.2”条件进行测定。以盐酸美金刚的质量浓度(x，μg/mL)为横坐标，峰高(y，mV)为纵坐标进行线性回归，得盐酸美金刚的线性范围为10～2 000 μg/mL，回归方程为y=0.596 4x+52.68(r2=0.999 1)。分别以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)得到盐酸美金刚的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)分别为7 μg/mL和10 μg/mL。

2.7.2 精密度实验取对照品贮备液适量，按“1.3.3”方法制备质量浓度为100 μg/mL的对照品溶液。取上述溶液，按“1.2”条件重复进样测定6次，结果显示盐酸美金刚峰高的相对标准偏差(RSD，n=6)为1.3%，表明仪器精密度良好。

2.7.3 稳定性实验取样品(批号:81216202)适量，按“1.3.2”方法制备质量浓度为100 μg/mL的供试品溶液。分别于4 ℃下避光放置 0、2、4、8、12、24 h，按“1.2”条件进样测定，结果显示盐酸美金刚峰高的RSD(n=6)为1.6%，表明供试品溶液在 4 ℃下放置 24 h内稳定性良好。

2.7.4 重复性实验精密称取同一批次样品(批号:81216202)适量，共6份，精密称定，按“1.3.2”方法制备质量浓度为100 μg/mL的供试品溶液。按“1.2”条件进样测定，结果显示盐酸美金刚峰高的RSD(n=6)为1.8%，表明本方法重复性良好。

2.7.5 加标回收率实验精密称取样品适量(批号:81216202)，共9份，分别置于10 mL容量瓶中，各加入低、中、高3个水平的对照品，按“1.3.2”方法制备供试品待测液，在“1.2”条件下进样测定，记录峰高并计算加标回收率，结果见表1。结果显示，盐酸美金刚的平均加标回收率为96.5%～99.2%，RSD为3.0%，表明该方法准确度良好。

表1 加标回收率实验结果(n=9)

2.8 样品测定

取供试品贮备液1 mL，置于20 mL容量瓶中定容(约含盐酸美金刚100 μg/mL)，按“1.2”条件进样测定，记录电泳色谱图与峰高，并计算盐酸美金刚的质量浓度，结果见表2。结果显示，3批次样品测定的平均质量分数为99.46%～103.27%，RSD为0.60%～2.1%，表明该方法在不同批次样品测定中的重复性良好。盐酸美金刚片供试品溶液的电泳色谱图见图3,盐酸美金刚的保留时间低于18 s。