于壮壮，康天放，鲁理平

(北京工业大学 区域大气复合污染防治北京市重点实验室 环境与能源工程学院，北京 100124)

四环素(TC)是一类用于治疗感染性疾病的抗生素，具有广谱的抗菌性和较低的成本，已广泛用于疾病预防、感染治疗、畜牧业和水产养殖业等。但四环素类药物的滥用会在肉类、牛奶、蜂蜜、鸡蛋等动物源食品中造成较高的残留，过量摄入不仅会引起人体视力衰减、牙齿变色等问题，还会使某些过敏个体产生过敏性反应和抗药性等症状[1-2]。世界卫生组织和欧盟将牛奶中四环素的最大残留量(MRL)设定为100 mg/L，美国食品和药物管理局(FDA)规定牛奶中四环素的MRL为80 mg/L[3]，我国规定无公害水产品中四环素、金霉素、土霉素的MRL均为100 μg/kg[4]。环境中四环素残留问题已引起全球关注，因此建立一种可以实现对食品、药物制剂和水中四环素选择性富集和检测的方法具有重要意义。目前，四环素的检测方法主要有分光光度法[5]、高效液相色谱法[6]、化学发光法[7]、微生物法[8]、免疫法[9]、毛细管电泳法[10]等，然而这些方法存在样品前处理过程复杂、所需时间长、仪器价格昂贵、灵敏度低、重现性差等缺点。

分子印迹是指在模板分子存在下功能单体聚合形成聚合物，使模板分子和功能单体之间通过非共价键、可逆的共价键等结合在一起，当聚合物中的模板分子被洗脱后，形成与模板分子大小、形状及作用位点相匹配的空腔，该空腔可特异性识别模板分子。分子印迹聚合物(Molecular imprinting polymer，MIP)具有预定性、识别性和实用性，基于MIP的电化学传感器具有选择性高、响应快速、操作简便等优势[11]。近年来，关于四环素分子印迹传感器的研究已有一些报道[12-13]。金纳米粒子(AuNPs)具有比表面积大、电催化活性高和导电性优异等性能，与MIP具有良好的共容性和稳定性[14-15]。石墨烯量子点(GQDs)是尺寸小于100 nm的石墨烯片，具有显著的量子限域和边缘效应、较大的比表面积、良好的电子迁移速率和化学稳定性[16-17]，因此可以提高分子印迹膜对目标分子识别的灵敏度。

本研究将金纳米粒子电化学沉积在裸玻碳电极表面，通过Au-S键结合的方式将4-氨基苯硫酚(4-ATP)自组装到AuNPs/GCE电极表面，然后将石墨烯量子点(GQDs)修饰到电极表面。以4-氨基苯硫酚为功能单体，TC为模板分子，采用电化学聚合的方法制备了TC分子印迹膜，从而成功构建了四环素分子印迹电化学传感器(MIPs/GQDs-AuNPs/GCE)。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

电化学实验在CHI 660E电化学分析仪(上海辰华公司)上进行，采用三电极系统：以玻碳电极或修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。BS124S型电子天平(上海天平仪器厂)；KQ218型超声波清洗仪、KQ400KDE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；79-1型恒温加热磁力搅拌器(天津市工兴电器厂)；SU-8010型扫描电子显微镜(日本日立公司)；JEM2011透射电子显微镜(日本JEOL公司)。

四环素、4-氨基苯硫酚、卡那霉素、氯霉素、硫酸链霉素、硫酸新霉素、土霉素均购于百灵威试剂有限公司；氯金酸固体(HAuCl4·4H2O，Au%>47%)购于北京化学试剂有限公司；无水乙醇、甲醇、磷酸二氢钠购于北京化工厂；冰乙酸购于天津市光复科技发展有限公司；柠檬酸、氢氧化钠、磷酸氢二钠、氯化钠、六水合铁氰化钾、亚铁氰化钾购于天津市福晨化学试剂厂。实验中所用试剂均为分析纯，实验用水为Milli-Q Advantage A10超纯水系统(法国Millipore公司)制备的超纯水。

1.2 分子印迹传感器的制备

1.2.1 石墨烯量子点的制备将2.0 g柠檬酸加入100 mL三口烧瓶中，油浴锅中加热至200 ℃，柠檬酸发生液化，通过热解反应使柠檬酸分子之间脱水缩合，颜色由无色逐渐变为浅黄色，30 min后即形成橙色石墨烯量子点[18]，将其逐滴加入到100 mL 10 mg/mL的氢氧化钠溶液中，搅拌均匀，调节其pH值至7.0，即制得20 mg/mL的石墨烯量子点溶液，保存于4 ℃冰箱中，备用。

1.2.2 GQDs-AuNPs/GCE的制备将玻碳电极分别用0.5 μm和50 nm的α-Al2O3粉末抛光成镜面，再依次用超纯水、无水乙醇、超纯水各超声清洗5 min，氮气吹干后备用。将该电极置于含5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.1 mol/L KCl溶液中，在-0.2～0.6 V电位范围内以100 mV/s的速率循环伏安扫描15圈。将预处理好的玻碳电极置于20 mL含0.5 g/L HAuCl4的0.1 mol/L H2SO4溶液中，在-1.5～0.5 V的电位范围以50 mV/s的速率循环伏安扫描15圈，使金纳米粒子电沉积于玻碳电极表面，制得AuNPs/GCE修饰电极。再移取10 μL 2 mg/mL GQDs溶液滴涂到AuNPs/GCE表面，于室温下晾干，制得GQDs-AuNPs/GCE修饰电极。

1.2.3 MIPs/GQDs-AuNPs/GCE的制备四环素分子印迹电化学传感器的制备过程见图1A。将AuNPs/GCE电极放入含20 mmol/L 4-ATP的乙醇溶液中，浸泡12 h，进行自组装，使AuNPs与4-ATP通过Au-S键结合(图1B)[19]。再将10 μL 2 mg/mL GQDs溶液滴涂到该电极表面，自然晾干。以TC为模板，4-ATP为功能单体，将该修饰电极置于20 mL含20 mmol/L 4-ATP和10 mmol/L TC的磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH 7.0)中，于-0.4～ 0.6 V的电位范围内以50 mV/s的速率循环伏安扫描15圈，使其在电极表面电聚合形成分子印迹膜，超纯水冲洗后，将该电极浸泡到甲醇-乙酸(体积比9∶1)洗脱液中，搅拌10 min，除去TC模板分子，即制得MIPs/GQDs-AuNPs/GCE传感器。非分子印迹电极(NIPs/GQDs-AuNPs/GCE)制备过程中除不加模板分子TC外，其余步骤同上。

图1 TC分子印迹电化学传感器的制备过程(A)及4-ATP在AuNPs上的自组装示意图(B)

1.2.4 测定方法移取20 mL含有不同浓度TC的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.0)于电解池中，通氮除氧5 min，以MIPs/GQDs-AuNPs/GCE为工作电极，采用线性扫描伏安法(LSV)，在1.1～1.4 V电位范围内以50 mV/s的速率进行阳极扫描，记录不同浓度TC的氧化峰电流。

2 结果与讨论

2.1 纳米材料及TC分子印迹膜(MIPs)的表征

由AuNPs在裸玻碳电极表面的扫描电镜(SEM)图(图2A)可见，采用电沉积法制备的金纳米粒子粒径分布比较均匀，其平均粒径约80 nm。GQDs悬浊液的透射电镜(TEM)图显示，制备的石墨烯量子点较为分散，平均直径约65 nm(图2B)。在GQDs-AuNPs/GCE电极表面电聚合分子印迹聚合物后，其颗粒尺寸明显增大，从MIPs/GQDs-AuNPs扫描电镜图可见其表面空隙较多(图2C)，分布更为均匀，而非印迹膜NIPs/GQDs-AuNPs(图2D)较为团聚，且表面空隙少。

图2 修饰材料的扫描电镜图和透射电镜图

图3 分子印迹膜电聚合的循环伏安曲线

在预组装溶液中，功能单体4-ATP的—SH硫原子与电极表面修饰的AuNPs通过Au—S键结合，在电极表面形成4-ATP分子自组装膜[20]，在含模板分子TC的电聚合溶液中，于-0.4～0.6 V电位范围内循环伏安扫描15圈，在修饰电极上电聚合生成TC分子印迹膜。由图3可见，在0.53 V左右出现一个明显的氧化峰，这与文献报道基本一致[15]。之后随着扫描圈数的增加，电流强度明显减小且逐渐趋于稳定，表明随着电聚合的进行，电极表面逐渐形成了具有一定导电性的致密分子印迹膜。非分子印迹膜的电聚合循环伏安曲线与分子印迹膜的基本一致，4-ATP在0.53 V电位下发生氧化，出现一个明显的氧化峰，之后随着扫描圈数的增加，电流强度也明显减小且逐渐趋于稳定，这表明4-ATP的电聚合不会因TC的存在而受到干扰，且TC在该电位范围内没有被氧化而出现其它明显的氧化峰，与文献报道结果一致[12-13]。

2.2 不同修饰电极的电化学特性

在含5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.1 mol/L KCl溶液中，以玻碳电极或修饰电极为工作电极，在-0.2～0.6 V电位范围内进行循环伏安扫描(图4A)。结果显示，相对于裸玻碳电极(曲线a)的循环伏安图，当在电极表面电沉积AuNPs后(曲线b)，氧化峰电流略有增大且峰电位负移，表明在电极表面电沉积AuNPs后，其优异的导电性能和电催化作用降低了电化学反应的活化能，从而促进了[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-电对在AuNPs/GCE表面的氧化还原反应。当在裸玻碳电极表面修饰GQDs后(曲线c)，其峰电流值明显减小，表明GQDs表面的羟基和羧基负电基团[18]与[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-电对之间存在静电排斥作用，阻碍了该电对的氧化还原反应。该电对在GQDs-AuNPs/GCE (曲线d)上的峰电流值明显要比在AuNPs/GCE(曲线b)和裸GCE(曲线a)上的峰电流值大，这归因于AuNPs良好的导电性和GQDs大的比表面积，为界面的电子转移提供了良好的基底，并使得在电催化反应中产生协同效应，并使得电流明显增大。当在GQDs-AuNPs/GCE电极表面电聚合分子印迹膜(MIPs)后，[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-电对在MIPs/GQDs-AuNPs/GCE电极上的循环伏安扫描曲线中未出现氧化还原峰(曲线e)，说明在电极表面成功电聚合了致密的分子印迹膜，阻碍了该电对在MIPs膜中的传输。将MIPs/GQDs-AuNPs/GCE电极置于甲醇-乙酸(体积比9∶1)溶液中洗脱后，再在K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中进行循环伏安电位扫描，氧化还原峰电流明显增加(曲线f)，表明模板分子TC已被成功洗脱，形成了与TC结构相对应的特异性分子印迹空穴，使电极表面有了更多的氧化还原位点和离子通道，从而使部分[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-离子探针可以扩散到电极表面发生氧化还原反应。而NIPs/GQDs-AuNPs/GCE电极在洗脱前后的循环伏安曲线基本未发生变化(曲线g)，未出现氧化还原峰，说明功能单体4-ATP在电极表面形成了一层致密的不导电聚合物膜，阻碍了电子的传递。

在含5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.1 mol/L KCl溶液中，采用交流阻抗法(EIS)进一步研究了不同修饰电极界面的电化学特性(图4B)。图中高频率区半圆部分相当于有效电子转移过程，其半圆直径等于电子转移阻抗(Ret)，低频率区的直线部分代表扩散过程。由图4B可见，裸玻碳电极的阻抗值为200 Ω(曲线a)，AuNPs修饰电极的阻抗为80 Ω(曲线b)，比裸玻碳电极的阻抗小很多；在电极上修饰GQDs后电极阻抗值为1 100 Ω(曲线c)，阻抗明显增大，而同时修饰AuNPs和GQDs后电极阻抗值为125 Ω(曲线d)，说明二者的结合能够促进电子的传递。印迹电极洗脱前的阻抗值为600 Ω(曲线e)，与GQDs-AuNPs/GCE相比，MIPs/GQDs-AuNPs/GCE的阻抗明显增大，而印迹电极洗脱后阻抗值为240 Ω(曲线f)，其阻抗明显减小。非印迹电极的阻抗值为1 500 Ω(曲线g)，要比印迹电极洗脱前的阻抗大很多，这表明4-ATP在电极表面形成了一层非常致密的非导电性聚合物膜。以上结果与循环伏安法的电流表征结果一致。

2.3 TC在不同电极上的电化学行为

已有研究显示[21]，四环素在强酸和碱性介质中的稳定性较差，会迅速发生同分异构转变，而金纳米粒子在酸性介质中的氧化还原反应会影响对四环素氧化峰位置的判断，因此，本文采用循环伏安法在含10.0 mmol/L TC的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.0)中研究其在不同修饰电极上的电化学行为(图5A)。结果显示，在裸玻碳电极(曲线a)和AuNPs/GCE电极(曲线b)上未出现氧化峰，表明裸玻碳电极和AuNPs/GCE对TC无响应；而在GQDs-AuNPs/GCE电极于1.12 V电位左右产生了一个较小的氧化峰(曲线c)，表明AuNPs与GQDs在电催化反应中产生协同效应，氧化了TC分子中10号位的酚羟基;在MIPs/GQDs-AuNPs/GCE电极上则于1.24 V产生了一个比较灵敏的氧化峰(曲线d)，这是由于分子印迹电极表面存在与TC相对应的空穴，能够特异性识别TC，促进其在电极表面的氧化反应;而对于非印迹电极(NIPs/GQDs-AuNPs/GCE)，因其表面存在致密的非导电性聚合物膜，抑制了电子的转移，因此电流明显降低且未出现任何氧化峰(曲线e)。由分子印迹电极(MIPs/GQDs-AuNPs/GCE)在0.1 mol/L PBS空白溶液和含有2.5 mmol/L TC的PBS溶液中的循环伏安曲线(图5B)可见，分子印迹电极在空白溶液中于1.3 V附近未出现明显的氧化峰，而在TC溶液中于1.3 V出现明显的氧化峰，表明位于1.3 V的氧化峰确实是由TC的电化学氧化所产生。

图5 不同电极(A)和MIPs/GQDs-AuNPs/GCE电极(B)在TC溶液中的循环伏安图

TC的电化学氧化反应机理如图6所示[22]。在整个反应过程中，一部分TC分子结构中10号位上的酚羟基会先失去1个电子和1个质子，变成不稳定的自由基，而后在高阳极电位下，迅速失去另1个电子，变成较稳定的醌式结构。而另一部分TC则直接失去2个电子和1个质子，变成稳定的醌式结构。

图6 四环素的电化学氧化还原反应机理图

2.4 实验条件的优化

2.4.1 AuNPs负载量通过改变循环伏安扫描圈数来优化电极表面AuNPs的修饰量。将裸玻碳电极置于含0.5 g/L HAuCl4的0.1 mol/L H2SO4溶液中，分别循环伏安扫描3、5、10、15、20、25圈，其余条件不变，制得不同AuNPs修饰量的分子印迹电极，于TC溶液中测定其氧化峰电流。结果显示，随着扫描次数的增加，TC氧化峰电流逐渐增大，当扫描圈数为15圈时，电流响应值最大，此后氧化峰电流有所减小，因此本文选择电沉积15圈为AuNPs最佳负载量。

2.4.2 GQDs修饰量石墨烯量子点具有较大的比表面积，可使分子印迹膜在电极表面形成更多的识别位点，本研究通过改变GQDs的修饰量(3、5、10、15、20、25、30、35、40 μL)来提高分子印迹传感器的灵敏度。结果发现，TC氧化峰电流随GQDs修饰量的增大而增大，当GQDs修饰量为20 μL时，电流响应值最大，之后电流值又逐渐降低。因此，本文选择GQDs的最佳修饰量为20 μL。

2.4.3 分子印迹聚合物修饰量电极表面分子印迹膜的厚度会影响传感器的灵敏度，实验通过改变分子印迹膜电聚合的圈数(3、5、10、15、20、25圈)来优化传感器。结果显示，随着扫描圈数的增加，电流逐渐增大，当扫描圈数达到15圈时，TC氧化峰电流最大，之后电流又逐渐降低。表明当电聚合少于15圈时，分子印迹膜较薄，富集到印迹膜中的TC量较少，造成电流响应不够灵敏；而当电聚合圈数超过15圈后，分子印迹膜又过厚，TC在印迹膜中的传输阻力增大，既降低了传感器对TC的响应灵敏度，又增加了模板分子的洗脱难度。因此，本文选择循环伏安扫描15圈为制备的电聚合分子印迹膜的最佳膜厚度。

2.4.4 模板分子化学洗脱时间将分子印迹电极浸泡到甲醇-乙酸(体积比9∶1)溶液中，考察不同搅拌洗脱时间(2、4、6、8、10、12、15 min)的影响。结果显示，在分子印迹膜洗脱过程中，若洗脱时间过短会使洗脱掉的模板分子过少，从而增大分子印迹电极的空白电流；随着洗脱时间的延长，传感器对TC的响应电流灵敏度相应增大，当洗脱时间为8 min时，TC氧化峰电流最大，再进一步延长洗脱时间，峰电流不再增大，说明当洗脱时间达到8 min时，印迹膜中的模板分子已被完全洗脱。故本文选择最佳模板洗脱时间为8 min。

图7 MIPs/GQDs-AuNPs/GCE传感器的LSV图

2.5 工作曲线、重现性、稳定性及选择性

在最优实验条件下，采用线性扫描伏安法(LSV)考察了该分子印迹传感器对TC的检测性能。以含有不同浓度TC的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)为底液，在1.1～1.4 V电位范围内以50 mV/s的速率扫描(图7)，结果显示，随着TC浓度的增加，其氧化峰电流逐渐增大。氧化峰电流值(Ip,μA)与TC浓度(c,μmol/L)在2.0×10-8～3.0×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为Ip(μA)=2.981 0c(μmol/L)+25.485 3，相关系数(r)为0.999 4，检出限为1.5×10-9mol/L(S/N=3)。将本文制备的分子印迹电化学传感器与近些年相关文献报道的TC检测方法进行比较，发现本文制备的分子印迹传感器线性范围更宽，对TC的检出限更低(表1)。

表1 不同方法检测TC的比较

采用相同方法制备6支分子印迹电化学传感器，在2.5 μmol/L TC的PBS溶液(pH 7.0)中分别记录LSV曲线，测得6支传感器对TC响应峰电流的相对标准偏差(RSD)为3.5%，说明该分子印迹电化学传感器具有良好的重现性。

将电极存放在冰箱中，于4 ℃环境下保存15 d后检测5.0×10-6mol/L 四环素的氧化峰电流值为36.35 μA，保持了原初始电流的95.6%(初始电流38.02 μA)，表明该分子印迹传感器具有较高的稳定性。

选择卡那霉素(KA)、氯霉素(CAP)、硫酸链霉素(ST)、硫酸新霉素(NE)以及与四环素具有相似结构的土霉素(OTC)为干扰物质来研究分子印迹电极的选择性。将制备好的分子印迹电极分别置于含有1.0×10-6mol/L上述干扰物的0.1 mol/L PBS溶液(pH 7.0)中，采用线性扫描伏安法测定各物质的氧化峰电流值，结果显示，TC的峰电流值要远大于其他各干扰物质，表明该分子印迹电化学传感器对四环素具有良好的选择性。

2.6 实际样品的检测

采用本文制备的分子印迹传感器检测牛奶和河水中的四环素。取5.0 mL牛奶(市售某品牌)与10.0 mL无水乙醇混合超声处理20 min，然后将混合物离心10 min，过滤后收集滤液，用超纯水定容至30 mL，于4 ℃冰箱中保存。水样采自于北京市丰台区凉水河，过0.45 μm滤膜后保存。将印迹电极置于含样品溶液的0.1 mol/L PBS溶液(pH 7.0)中，测定TC的电流响应值。采用相同方法制备各样品的加标溶液(牛奶加标浓度为0.02、0.04、0.07 μmol/L，河水加标浓度为1.0、2.0、3.0 μmol/L)进行回收率实验，每个浓度平行测定3次，分别计算回收率和相对标准偏差(RSD)。结果在牛奶和河水样品中均未检出TC，3个不同浓度下TC的回收率为97.9%～106%，RSD为1.8%～4.7%。

3 结 论

本文基于金纳米粒子和石墨烯量子点成功构建了用于TC检测的分子印迹电化学传感器(MIPs/GQDs-AuNPs/GCE)，并将其应用于实际样品(牛奶和河水)的测定。由于AuNPs和GQDs具有导电性好、比表面积大、生物相容性好等优异特性，在电催化反应中产生的协同作用提高了传感器的灵敏度，并提供了更多的TC分子识别位点。该方法选择性和稳定性好，线性范围宽，操作简便，成本低，对于食品和水环境中TC检测具有良好的应用前景。