康 燕，孙 琳，吴 婷，杜一平

(华东理工大学 化学与分子工程学院 分析测试中心，上海 200237)

表面增强拉曼散射(Surface enhancement Raman scattering,SERS)是由拉曼光谱衍生出来的一种新型的高灵敏光谱技术，是在粗糙化的贵金属(如纳米金、银等)衬底上产生的、通过局域表面等离子共振而放大的拉曼信号[1-4]。通过这种技术，能将常规的拉曼信号增强十万到百万倍，极大地提高拉曼光谱的灵敏度，使得拉曼光谱能够用于痕量化合物分析。近年来，人们开始将SERS技术与各种技术联用，充分利用SERS的优点并扩大其应用范围，如将SERS与原子力显微镜[5]、微流控技术[6]等联用。但是，由于光谱技术不具备分离功能，无法对混合体系的谱峰进行归属，从而使得SERS技术在复杂体系分析中受到限制。

薄层色谱法(Thin layer chromatography,TLC)是一种能够对混合物进行快速分离的色谱技术，因具有简单、价廉、分离速度快等优点而被广泛应用[7-9]。TLC方法作为经典的分离分析方法，具有很多优点，但将其用于定性鉴别时灵敏度低，分析能力差，结果稳定性欠佳。将TLC和SERS联用，充分结合了TLC技术经济、快捷、高效的优点和SERS灵敏度高、指纹信息丰富的特点。目前，TLC-SERS已经应用于医药、环境、考古、食品安全等领域。朱青霞等[10]用TLC-SERS技术对降糖类中成药中非法添加的4种化学药品进行了检测；吕迪亚等用此方法对减肥类中成药中掺假的麻黄碱及其类似物进行了检测[11]。传统中草药钩藤中的活性成分异钩藤碱也可经薄层色谱分离后利用SERS技术进行快速检测[12]。TLC-SERS技术对药物的现场快速打假有重大意义，不仅有利于维护药品市场秩序，也有利于保障人民群众用药安全。除了在药物领域的应用外，TLC-SERS也被应用于环境领域，渠陆陆等[13]采用TLC-SERS技术对河水中10多种芳香族污染物进行了定性和半定量分析。该技术也同样被成功应用于对古油画上的有机染料成分进行分离和检测[14]。Tan等[15]将该联用技术用于海产品中组织胺的定量分析。在前期工作中，本课题组将TLC-SERS技术成功应用于果蔬中农残的分析检测[16-17]。尽管TLC-SERS具有很多优点，适合快速分离分析，但由于TLC的分离效率不高，难以应用于成分复杂的样本。此外，当采用溶胶作为SERS基底时，纳米颗粒的不可控团聚也使得这种联用方法的重复性较差。为使TLC-SERS适用于更复杂的样本分析，本文采用二维TLC技术进一步提高分离效率；同时，在SERS基底的可控制备方面，采用金纳米粒子修饰的介孔二氧化硅来提高基底的稳定性和重复性。

糖精钠化学名邻苯甲酰磺酰亚胺钠，是食品中常用的合成甜味剂，使用范围广泛。糖精钠的甜度比蔗糖高300～500倍，但其在人体内不被分解，对人体无任何营养价值，且会影响肠胃消化酶的正常分泌，降低小肠的吸收能力，使食欲减退。中国消费者协会对国内近百种不同类型、档次饮料的调查表明，大约有55.1%的饮料中含有糖精钠[18]。此外，GB/T 2760-2014 标准明文规定禁止在鲜果中添加糖精钠[19]，但是水果中添加糖精钠增加甜度的现象时有发生，严重危害消费者的健康。因此，建立快速的、高选择性的糖精钠分析方法，为食品安全保驾护航，具有实际意义。

本工作将构建的二维TLC-SERS技术成功应用于饮料和水果中糖精钠的分析，开发了一种新的糖精钠快速分析方法。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

Santa Barbara Amorphous-15，浙江嘉兴探骊新材料研发有限公司)。对巯基苯胺(PATP)、罗丹明6G(R6G)、氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。糖精钠购于上海贤鼎生物科技有限公司。氯金酸、柠檬酸三钠、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、乙腈、异丙醇、乙醇、甲醇、甲酸、磷酸、正己烷、氨水、正丁醇、乙醚、二氯甲烷均为分析纯，购于国药(集团)化学试剂有限公司。实验中使用的薄层层析板从上海集聚盛化工有限公司采购。所有溶液均用超纯水设备Sartorius arium 611 DI( Germany )制备的Milli-Q水配制(电导率18 MΩ·cm)。饮料和水果购于超市。

InVia激光显微拉曼光谱仪(英国Renishaw公司)：激发光源514.5 nm，Ar+离子激光器，光栅刻线 1 800 l/mm。基底的表面形貌用扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)(S-4800，Hitachi，Japan)进行表征。

1.2 金溶胶合成

金溶胶的合成方法参照文献[20]，在250 mL烧瓶中加热50 mL 1 mmol/L的氯金酸溶液至沸腾状态，加入1.85 mL 38.8 mmol/L的柠檬酸三钠溶液，保持沸腾回流加热15 min，待冷却后装入棕色试剂瓶中保存待用，制得的金溶胶呈酒红色。

1.3 Au@ SBA-15 SERS材料的制备

将60 mg SBA-15 分散于80 mL异丙醇中并搅拌均匀，加入1 mL氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)原液，然后在氮气保护下将混合物加热至接近回流(约80 ℃)并搅拌8 h，将固体过滤，并用无水乙醇和去离子水分别洗涤3次后于80 ℃干燥12 h，得到氨基改性SBA-15 介孔材料。取30 mg 改性SBA-15粉末于5 mL具塞式离心管中，加入2 mL去离子水，超声分散均匀，加入2 mL金溶胶，在振荡器上以1 000 r/min振荡1 h后静置，即得金纳米颗粒修饰的SBA-15(Au@SBA-15)[21]材料。最后用去离子水冲洗，以去除未负载到材料上的金纳米颗粒。

1.4 饮料及水果中糖精钠的分离与检测

市售饮料加热除去CO2后再进行检测。在薄层板下端1 cm处，用点样毛细管点上处理好的样品，第一次展开以乙醚-二氯甲烷-醋酸(8∶2∶1，体积比)为展开剂，将点好的薄层板放入盛有展开剂的展开槽中，展开剂液层约0.5 cm，并预先已达到饱和状态。待第一次展开完成后，将薄层板旋转90°，沿着另一个方向进行第二次展开，第二次展开采用正丁醇-氨水-无水乙醇(7∶1∶2，体积比)为展开剂，展开后将Au@SBA-15基底滴洒在薄层斑点原位(紫外灯下观察)，采集斑点位置的SERS光谱。

对于水果中糖精钠的检测，样品处理如下：取红枣于搅拌机中搅成匀浆状，称取10 g于50 mL具塞离心管中，加入40 mL甲醇，振荡8 min，超声提取8 min，3 000 r/min离心，取上层清液，用双层滤纸过滤后再经0.45 μm滤膜过滤。第一次展开采用乙醚-二氯甲烷-醋酸(8∶2∶0.5，体积比)为展开剂，将点好的薄层板放入盛有展开剂的展开槽中，展开剂液层约0.5 cm，并预先已达到饱和状态。待第一次展开完成后，将薄层板旋转90°，沿着另一个方向进行第二次展开，第二次展开采用正丁醇-氨水-无水乙醇(7∶2∶2，体积比)为展开剂，展开后将Au@SBA-15基底滴洒在薄层斑点原位(紫外灯下观察)，采集斑点位置的SERS光谱。

2 结果与讨论

2.1 SERS材料(Au@SBA-15)的表征

按照“1.3”方法对SBA-15介孔材料进行氨基改性，材料修饰金纳米颗粒前后的SEM图见图1。从图中可以看出，大量的金纳米颗粒均匀地分散在介孔材料表面，说明改性材料对纳米颗粒的亲和力高，可形成足够的SERS活性位点。

图1 SBA-15(A)和Au@SBA-15(B)的SEM图

图2 不同浓度R6G的SERS谱图

2.2 基底的灵敏度与点-点重复性

本文采用R6G来考察基底的SERS活性。图2为不同浓度R6G在Au@SBA-15材料上的SERS谱图。由图可以看出，随着R6G分子浓度的降低，SERS信号逐渐减弱，但R6G浓度为10-10mol/L时仍然能够清晰地观察到其特征信号，说明此基底具有良好的SERS活性。

良好的SERS基底的均匀性(点-点重复性)是固相基底的一个重要指标。为了验证基底不同位置之间增强能力的差异，对基底进行mapping扫描。随机选择1个基底，采用10-7mol/L PATP作为探针分子，选择12 μm×20 μm大小的区域，每个点间隔4 μm，采用514.5 nm Ar+离子激光器，积分3 s，累积1次，采集 24张谱图，所采集到的谱图见图3A。从图可以看出，在该区域内所获得的24张谱图峰高差异不大，所测区域内每个点都能产生较为一致的增强效果。记录每个检测点上谱图在1 436 cm-1处特征峰的强度(图3B)，经计算，这24个测量点峰强度的相对标准偏差(RSD)为5.9%，说明其SERS信号强度差异较小，基底具有较好的均匀性。

为了说明不同批次制备得到的SERS基底的重复性，对9个批次基底进行考察。以10-7mol/L PATP作为探针分子，每个批次随机采集5张光谱，并计算其在1 436 cm-1处峰高的平均值。9个批次光谱的平均信号强度如图4所示。经计算，该9批基底上所采集到的信号值的RSD为7.5%，表明基底具有良好的批-批重复性，制备方法的重复性高。

图3 SERS基底的点-点重复性

图4 不同批次制备基底上采集到的10-7 mol/L PATP的信号强度(1 436 cm-1)

图5 不同质量浓度糖精钠的SERS信号曲线

图6 饮料样品经二维TLC展开后的照片(A)与薄层板上b点采集到的SERS光谱图(B)

2.3 基底对不同质量浓度糖精钠标准溶液的响应

2.4 二维TLC-SERS联用技术用于饮料及水果中糖精钠的检测

将二维TLC-SERS联用技术用于实际样本饮料和水果中糖精钠的检测。采用“1.4”前处理方法，饮料样本经过二维TLC展开后如图6所示，图中b点检测到了糖精钠的信号，其特征峰和标样峰基本一致，可以确定糖精钠的存在。记录709 cm-1位置的峰强，并用上述线性方程计算，测得饮料中糖精钠的质量浓度为(141±11.2)mg/L。对于红枣中糖精钠的测定，采用“1.4”中水果的处理方法进行展开和计算，得到红枣中糖精钠的质量浓度为(18±1.9)mg/L。为了验证方法的准确性，采用液相色谱法进行了平行检测，得到饮料和红枣中糖精钠的质量浓度分别为(149±9.6)mg/L和(20±1.6)mg/L。本方法测得结果与色谱法基本一致，两者的相对偏差(RD)分别为5.3%和10 %，说明本方法是一种可靠的快速分析方法。

3 结 论

本研究构建了一种二维TLC-SERS技术，采用纳米金修饰的二氧化硅微球作为SERS基底，将第一次没有分开的目标物成功从混合体系中分离，提高了色谱的分离能力,且灵敏度高。9个批次样本基底SERS信号的RSD值为7.5%，表明基底的可重复性高，能够可控制备。将该方法用于饮料和水果中糖精钠的快速分析，所得结果与液相色谱方法的RD值在10%以内。本方法操作简单，有望应用于食品中农残和其他添加剂的快速分析。