龚小见，赵 超，周 欣*

(1.贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵州 贵阳 550001；2.贵州师范大学贵州省药物质量控制及评价技术工程实验室，贵州 贵阳 550001；3.贵州师范大学 天然药物质量控制研究中心，贵州 贵阳 550001)

0 引言

黔产马兰草(KalimerisindicaL.)为菊科马兰属植物的带根全草。别名鱼鳅串、鸡儿肠、田边菊、蓑衣草、路边菊等，在全国各地均有分布，在贵州资源丰富[1]。黔产马兰草含有多种维生素、矿物质和氨基酸，营养丰富可作为蔬菜食用，兼有多种药理功效，是集食、药用价值于一身，备受青睐的时令野菜珍品[2-3]。黔产马兰草全草可入药，具有清热利湿，理气消食，解毒消肿等功效。用于治疗胃脘胀痛，感冒咳嗽，水肿，淋浊等症[4]。

黔产马兰草在贵州民间作为特色药材广泛使用，且目前有多家药厂以黔产马兰草药材做为原料生产中成药(如马兰感寒胶囊、感清糖浆等)。虽然黔产马兰草已被收录于《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003版)中，但在该标准中无含量测定项，不能有效控制药材质量，在一定程度上限制了黔产马兰草的更广泛应用。据文献报道，黔产马兰草中的化学成分为三萜类、黄酮类和甾体类化合物[5-18]。我们在对马兰的前期化学成分分研究中发现黔产马兰草药材中的大部分化合物为三萜类化合物，因此本次以黔产马兰草中总皂苷为研究对象，参照2015年版《中华人民共和国药典》(一部)采用紫外分光度法建立黔产马兰草中总皂苷含量测定方法，为更好地控制黔产马兰草药材质量提供科学依据。

本次实验建立采用紫外分光光度法建立了黔产马兰草中总皂苷的含量测定方法，对10批贵州不同产地马兰草中的总皂苷进行了含量测定，并进行数据分析。该方法操作简便、结果准确、重现性及稳定性好，回收率可靠，可用于黔产马兰草药材的质量控制方法。

1 材料与仪器

1.1 药材和试剂

马兰草药材均采自贵州不同地区，经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为马兰草(KalimerisindicaL.)，样品采集信息如表1所示。

表1 马兰草药材信息表Tab.1 Tested material of Kalimeris indica and their local variety

齐墩果酸对照品(纯度大于98%)，中国食品药品检定研究院；甲醇(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司产品；石油醚(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；香草醛(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；冰醋酸(分析纯)，天津市致远化学试剂有限公司；高氯酸(分析纯)，天津政成化学制品有限公司；水为蒸馏水。

1.2 仪器和设备

200 g摇摆式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；SPECTRA max PLUS 384光吸收酶标仪(美国分子仪器公司Molecular Devices)；AL 204万分之一分析天平和XS 105十万分之一分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；TDL-5A低速自动平衡离心机(常州市万合仪器制造有限公司)；HWS-28电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2 试验方法

2.1 标准溶液的配制

精密称取0.005 9 g已干燥恒重的齐墩果酸于10 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，定容，摇匀，即得0.59 mg/mL齐墩果酸标准品溶液。置于4 ℃冰箱中保存。

2.2 供试样品溶液制备

精密称取各产地的马兰样品0.200 0 g(精确到0.000 1 g)，加10 mL石油醚回流30 min，离心(3 500 r/min，5 min)，去掉上清液后，滤渣用10 mL甲醇于回流提取30 min，离心(3 500 r/min，5 min)，取上清液，定容至10.0 mL，待测。

2.3 检测方法及波长的确定

取一定量的齐墩果酸对照品溶液10 mL试管中挥干溶剂，依次加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸、0.8 mL高氯酸，于80 ℃水浴加热20 min，取出冰水浴20 min，加入5.0 mL冰醋酸，用紫外分光光度计，在400～700 nm波长下进行扫描(见图1)，结果在550 nm处有特征性吸收峰，故选择550 nm为检测波长。

图1 对照品齐墩果酸的紫外吸收Fig.1 UV absorption of oleanolic acid

2.4 标准曲线的绘制

精密量取齐墩果酸对照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于10 mL试管中，挥干溶剂，分别加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，置于80 ℃水浴中热水浴20 min，取出后冰水浴20 min，加入5.0 mL冰醋酸，在波长550 nm处测量吸光度值，同时以试剂为空白对照。以吸光度为纵坐标A，对照品溶液浓度为横坐标c，绘制标准曲线，结果见图2所示。得标准回归方程A=9.787 5c-0.030 6(r=0.999 8)，表明齐墩果酸在0.029～0.079 mg/mL范围内线性良好。

图2 齐墩果酸标准曲线Fig.2 The standard curve of oleanolic acid

2.5 稳定性试验

精密称取0.200 0 g马兰草药材(精确到0.000 1 g)，按2.2项下制备供试品，取0.5 mL供试品按2.3项方法测定，在550 nm波长处每隔5 min测定一次吸光度值，测定6次。所测吸光度值的RSD为0.90%，说明供试品溶液在30 min内稳定性良好。

2.6 精密度试验

精密称取0.200 0 g马兰草药材(精确到0.000 1 g)，按2.2项下制备供试品，取0.5 mL供试品按2.3项方法测定，在550 nm处进行吸光度测定吸光度，在30 min内平行测6份，RSD值为0.45%，说明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

精密称取0.200 0 g(精确到0.000 1 g)马兰草药材6份，按2.2项下制备供试品，取0.5 mL供试品按2.3项方法测定，在550 nm波长处测定吸光度，RSD值为0.77%，说明方法的重复性良好。

2.8 加标回收试验

精确称取马兰草样品9份，每份0.100 0 g(精确到0.000 1 g)，按80%、100%、120%加标准品，按2.2项下制备供试品，取0.5 mL供试品按2.3项方法测定，各平行3份显色检测，结果如表2所示，平均加样回收率为96.46%，RSD值为1.04%，结果表明回收率良好。

表2 加样回收实验Tab.2 Add recovery experiment

2.9 样品含量测定

精密称取各产地的马兰样品0.200 0 g(精确到0.000 1 g)，按2.2项下制备供试品，取0.5 mL供试品按2.3项方法测定，在550 nm处测定波长，计算含量。结果如表3所示，对10批次黔产地马兰草样品中总皂苷的含量测定，含量结果在1.86%～3.12%之间，说明黔产马兰草药材在总皂苷含量方面质量稳定均一。

表3 黔产地马兰总皂苷的含量Tab.3 Total Saponins of Kalimeris indica from different producing areas

3 讨论

3.1 显色方法的考查

实验对显色方法中的香草醛-冰醋酸用量、高氯酸用量、显色温度和显色时间进行了考查，结果表明，冰醋酸用量为0.2 mL、高氯酸用量为0.8 mL、显色温度为80 ℃和显色时间为25 min时吸光度值最高。

3.2 药材提取方法的考查

分别对提取方式、提取溶剂、料液比、提取时间以及药材粒度进行了考查，结果表明，提取方式为回流提取、提取溶剂为纯甲醇、溶剂用量为1∶50、提取时间为30 min和药材粒度为40目时，药材中的总皂苷含量最高。

3.3 药材含量测定结果讨论

本实验建立了黔产马兰草中总皂苷的含量测定方法，通过方法学考察，该方法精密度和重复性好、回收率高，且稳定可靠，操作简单实用，可用于黔产马兰草药材总皂苷含量测定。采用所建立的含量测定方法对采自贵州10个不同产地的马兰草药材进行了皂苷含量测定，结果发现，10个不同产地的马兰草药材中总皂苷含量均在在1.86%～3.12%之间，说明黔产马兰草药材在总皂苷含量方面质量稳定均一。