张佳琪,马新娜,张 萍,王 宁,邹云飞,纪元元,魏 萍 (东北农业大学 动物医学学院,黑龙江 哈尔滨150030)

食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)属嗜酸乳杆菌属,是乳酸菌中的一员,在人和动物的肠道健康中起重要作用。通过控制病原微生物的生长并调节肠道蛋白质网络以发挥抗病毒效应。食淀粉乳杆菌可以应用到牛和家禽的生产中,以促进动物的肥育,降低胆固醇,增加肠道酶的活性,促进有利于微生物水解的糖类物质生成,预防和治疗腹泻。NAKAMURA[1]在1981年从美国的玉米发酵成分中分离出12种淀粉水解菌株,首先对淀粉乳杆菌进行了描述。像乳酸杆菌和大肠杆菌一样,LEUNG等[2]在猪的粪便中发现食淀粉乳杆菌,并且指出其繁殖稳定,仅受到生物处理和粪便储存的轻微影响。MARTI等[3]通过研究揭示了食淀粉乳杆菌的基因序列,也为后人对食淀粉乳杆菌相关功能的研究提供了基础。经过本实验室前期的试验研究,已有张宏宇等[4]发现食淀粉乳杆菌对轮状病毒受体神经节苷酯GM3有影响,从而起到抗轮状病毒(rotavirus,RV)的效果。

HSC70是一种伴侣分子,是热休克蛋白HSP70家族的一员,作为RV 的受体在病毒黏附后期发挥作用[5]。该家族中的蛋白质是高度保守的核质ATP酶,其与许多功能相关,包括蛋白质折叠,跨生物膜的易位,以及寡聚复合物的组装和分解。在不同的应力条件下,这些蛋白质防止蛋白聚集体的形成,随后重折叠到天然状态或退化[6-7]。特别是,HSC70已被证明有利于蛋白质跨细胞膜转运,结合新生多肽,并从网格蛋白包衣中解离网格蛋白[8]。有研究发现,RV 与HSC70 在VP4 的亚单位结构VP5的第642～658 位氨基酸残基之间发挥作用。在RV 进入的过程中,有伴侣活性的HSC70还发挥了更积极的作用,可能引发病毒粒子的构象变化,使病毒进入细胞质或促进病毒粒子脱壳[9]。

本研究通过对食淀粉乳杆菌在乳鼠空肠组织中对RV 受体HSC70的调节作用的探究,揭示了食淀粉乳杆菌抗RV 的部分机制。

1 材料与方法

1.1 菌株、病毒与动物食淀粉乳杆菌为本实验室从猪粪便中分离保存;猪RV OSU 株从ATCC 引进;试验动物为清洁级3日龄中国昆明鼠乳鼠,经A组RV ELISA 试剂盒检测粪便中RV-Ag为阴性,购自哈尔滨医科大学。

1.2 主要试剂与仪器猪源热休克蛋白同源物HSC70定量检测试剂盒购自北京诚林生物科技有限公司。兔抗HSC70多克隆抗体、FITC 标记的山羊抗兔IgG 均购自北京博奥森生物技术有限公司。RNAeasy动物RNA 抽提试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。Eva Green 2×qPCR Master Mix、5×All-In-One RT Master Mix购自美国ABM 公司。自动酶标检测仪为Lab systems Multiskan MS type.352。冰冻切片机购自德国莱卡公司。荧光正置显微镜购自OLYMPUS,TOKYO。实时荧光定量PCR 仪型号为ABI7500等。

1.3 试验动物分组根据本试验室张宏宇等[4]、马新娜等[10]在前期构建的小鼠模型,本试验采用经MRS液体培养基3次活化浓度为106CFU/m L 的食淀粉乳杆菌,经MA104 细胞复壮至滴度为10－5.68TCID50/m L的RV。试验分为4组,分别为食淀粉组(gavaged probiotic before inoculation group,BI group):先灌喂的食淀粉乳杆菌后攻RV组、治疗组(gavaged probiotic after inoculation group,AI group):先攻毒后灌喂食淀粉乳杆菌组、病毒组及对照组,25 只每组,共饲喂11 d。从第1天开始,BI组每天灌喂50μL 的食淀粉乳杆菌,其他组每天喂食相同量的PBS;从第4天开始BI组每只乳鼠灌喂50μL RV,AI组灌喂50μL 的活菌后喂毒,并且所有试验鼠喂菌前禁食2 h,喂毒后禁食2 h以确保病毒被完全吸附。逐日选取空肠同一部位肠组织50 mg加入500μL PBS中充分研磨,研磨液与剩余空肠置于－80℃冰箱保存。

1.4 食淀粉乳杆菌对乳鼠空肠组织中HSC70的定量ELISA检测取1.3各组中50 mg空肠组织加入500μL p H7.4的PBS通过组织匀浆器振动15 s,间歇10 s,5 个循环研磨后,3 000 r/min 离心20 min,仔细收集上清分装检测,剩余样品冻存于－80℃冰箱。将各组空肠组织匀浆上清液按照北京诚林生物科技有限公司鼠源热休克蛋白同源物HSC70定量ELISA 检测试剂盒说明书操作,测定各组肠组织中HSC70的含量变化。

1.5 体内空肠组织HSC70的冰冻切片-间接免疫荧光检测(1)制备冰冻切片:冰冻切片机提前1 h预冷;取1.3 空肠组织切成适当大小,固定于载物台上,用OCT 复合物包埋,于切片机中冷冻30 min后切片;切片厚度7μm,将切好的切片黏于事先用APES处理过的载玻片上;切片于室温晾干40～60 min;置于丙酮中－20℃固定20 min,室温晾干5 min;4℃保存。(2)染色:将切片用PBS 洗涤3次;正常山羊血清用PBS按1∶100稀释,室温封闭20 min;用PBS 洗 涤;PBS 与 兔 抗HSC70 多 抗 按1∶500比例稀释,4℃孵育过夜;PBS洗涤3次;用PBS按1∶400的比例稀释FITC 标记的兔抗IgG,37℃避光孵育2 h;PBS洗涤3次;用DAPI复染细胞核,作用5 min;PBS洗涤3次;封片后将切片置于正置荧光显微镜下观察,阳性反应部位呈特异性绿色荧光,细胞呈蓝色。

1.6 实时荧光定量PCR

1.6.1 引物设计与合成 Mus-Actin引物由擎科生物技术公司提供;Mus-HSC70 根据GenBank 已发表的参考序列(登录号NC_037342.1),利用Primer 5.0设计荧光定量PCR 所需引物。Mus-HSC70上游 引 物:5′-GGGCTGAAAGGAATGTGC-3′,下 游引物:5′-GAACCACCCACCAGGACA-3′,预 期 扩增片段的长度为451 bp,引物由擎科生物公司合成。

1.6.2 肠组织总RNA 提取及反转录 取1.3各组肠组织50 mg加入600μL裂解液,于组织匀浆机中震动15 s,间歇10 s,5个循环研磨,后根据碧云天的RNAeasy动物RNA 抽提试剂盒说明书提取组织RNA,并测定RNA 浓度,根据ABM 公司的5×All-In-One RT Master Mix试剂盒将提取的各组空肠组织RNA 转录为cDNA,并测定每组cDNA 浓度,以备后续qPCR 试验。

1.6.3 待测样品的检测 取各组肠组织的c DNA模板扩增Mus-Actin、Mus HSC70基因。利用不同稀释梯度标准品为模板进行荧光定量PCR 试验,按照ABM Evagreen Express 2×qPCR Master Mix说明书进行试验操作,反应体系为10μL,包含Eva green 2×qPCR Master Mix 5.0μL,上、下游引物各0.3μL,cDNA 1.0μL,RNase free H2O 3.4μL。每一个样品,每一个引物做3个平行,每一组不同时间段都带有内参及阴性对照。反应条件:95℃预变性70 s;95℃30 s,95℃10 s,60℃30 s,共40个循环;95℃15 s,60℃60 s,95℃15 s。以β-actin为内参基因,所得的数据采用相对比较Ct法(Qr＝2－△Ct)分析,以确定小鼠空肠组织中HSC70的m RNA 表达量。

1.7 数据分析试验数据经Excel整理后,通过Statistix 8.1使用Turkey HSD 程序进行差异分析(P＜0.05),利用Prism8软件进行图表制作。

2 结果

2.1 乳鼠体质量变化及增长率哺乳期小鼠的体质量变化如图1所示,病毒组的质量高于其他组,但攻RV 后体质量增加平缓,低于其他组;正常组小鼠体质量在第11天时最高,并且持续增加;发现预防组在攻毒后并未出现过大波动,但治疗组小鼠攻RV 后增长缓慢,后期逐渐回复增长速率。

图1 乳鼠体质量变化

由表1可知,在未攻毒前1～4 d各组乳鼠的体质量增长率差异不显著(P＞0.05),在攻毒后5～11 d治疗组及病毒组的乳鼠体质量增长率显著降低(P＜0.05),其中病毒组显著低于预防组及治疗组(P＜0.05),正常组和预防组差异不显著(P＞0.05)。

表1 乳鼠体质量变化率

2.2 乳鼠空肠HSC70定量ELISA检测结果如图2所示,在未对小鼠进行攻毒处理第2天时,正常组热休克同源蛋白HSC70的含量同预防组无显著性差异(P＞0.05);第3天时预防组HSC70含量显著高于正常组(P＜0.05);第4天时,正常组热休克同源蛋白HSC70 的含量略高于预防组,差异不显著(P＞0.05)。第2天时乳鼠空肠各组HSC70 含量显著高于第3,4天(P＜0.05)。对小鼠攻毒后如图3所示,第5天时,正常组及预防组的热休克同源蛋白HSC70 含量显著高于治疗组和病毒组(P＜0.05);第7,11 天时,各组组内热休克同源蛋白HSC70的含量无明显差异(P＞0.05);第9天时,病毒组的热休克同源蛋白HSC70含量显著高于其他组(P＜0.05),其次,正常组热休克同源蛋白HSC70含量显著高于预防组与治疗组(P＜0.05)。

图2 攻毒前正常组与预防组热休克同源蛋白HSC70表达量 肩标不同字母表明差异显著(P＜0.05);肩标相同字母表明差异不显著(P＞0.05)。下同

图3 攻毒后各组热休克同源蛋白HSC70表达量 ∗.各组与第11 天比较的差异性:∗.表示差异显著(P ＜0.05),∗∗.表示差异极显著(0.01＜P＜0.05);∗∗∗.表示差异十分显著(P＜0.01)

2.3 冰冻切片-间接免疫荧光定位检测乳鼠空肠组织中HSC70的变化如图4 所示,HSC70 主要存在于肠绒毛外侧及肠组织细胞膜上,同时发现HSC70在RV 组的表达量最高,食淀粉乳杆菌作用后肠组织中阳性反应明显减弱,说明食淀粉乳杆菌可以降低HSC70的含量。

2.4 乳鼠空肠中HSC70的mRNA检测结果如图5所示,未攻毒处理前小鼠肠内HSC70 mRNA 含量随天数的增加而减少,正常组下降趋势显著(P＜0.05),预防组在第3,4天时趋于平缓。攻毒后如图6所示,小鼠肠内HSC70 m RNA 的相对表达量在第5,9天时无明显变化,差异不显著(P＞0.05);在第7,11天时HSC70 m RNA 的相对表达量呈现病毒组显著高于其他组(P＜0.05),预防组显著高于治疗组(P＜0.05)。在第5,7,11天时,HSC70 m RNA 的相对表达量呈现为病毒组＞预防组(P＜0.05),并且发现,小鼠肠内HSC70 m RNA 的相对表达量在第7天显著升高(P＜0.05)。

3 讨论

图4 乳鼠空肠组织冰冻切片-HSC70间接免疫荧光 A.正常组空肠组织;B.预防组空肠组织;C.治疗组空肠组织;D.病毒组空肠组织;蓝色荧光.细胞核染色;绿色荧光.HSC70抗体染色

图5 攻毒前正常组和预防组HSC70 m RNA 相对表达量

图6 攻毒后各组HSC70 m RNA 相对表达量

经过本实验室前期的试验研究,赵毅博等[11]发现食淀粉乳杆菌具有一定的抑菌作用,且对猪传染性胃肠炎(TGEV)的活力有抑制作用。田宗民等[12]发现食淀粉乳杆菌代谢产物可以通过改善细胞中紧密连接蛋白3、黏蛋白1等成分从而加强细胞对TGEV 的抵抗力。周传娜[13]通过对上清食淀粉乳杆菌上清蛋白的提取确定了不同量段上清蛋白的抗RV能力,确定了食淀粉乳杆菌代谢上清中存在抗RV 的小分子蛋白成分。考虑小分子成分的不稳定性,在体内试验中张宏宇等[4]通过对乳鼠灌喂食淀粉乳杆菌发现其对RV 受体神经节苷酯GM3有影响,马新娜等[10]发现对乳鼠灌喂食淀粉乳杆菌后能显著抑制RV 受体整联蛋白α2β1的合成,从而起到抗RV 效果。已知HSC70作为RV 受体之一,与整联蛋白相似,病毒在后附着步骤与HSC70相互作用[9,14]。我们知道热休克同源蛋白HSC70属于蛋白质是高度保守的核质ATP 酶,其与许多功能相关,包括蛋白质折叠,跨生物膜的易位,以及寡聚复合物的组装和分解。在不同的条件下,这些蛋白质防止蛋白聚集体的形成随后重折叠到天然状态或退化[15]。

有人研究了HSP27,HSP70 和组成型HSC70在仔猪胃肠道中的表达,发现回肠黏膜比结肠黏膜近端表现出更强的HSP27和HSP70表达,同时发现HSP27在代表空肠上皮的IPEC-J2细胞中以高水平表达[16]。在人类和啮齿类动物的研究已经证明,由于缺乏细菌的丰富性和多样性,热休克蛋白在正常的近端小肠几乎检测不到[17]。本试验通过ELISA 对乳鼠空肠组织研磨匀浆的检测结果发现,RV 在攻毒后48 h病毒复制能力最强,在72 h后逐渐下降,并逐渐趋于稳定,因此推测体内病毒受体的高含量导致RV 对幼畜易感。有报道指出,HSP在不同肠段表达的差异可能是由于不同部位的对膳食纤维的消化能力和细菌在小肠中的定植所引起的[18-20]。结合本试验结果,推测食淀粉乳杆菌降低了HSC70在空肠组织中的浓度,从而起到降低病毒进入细胞的能力。

对乳鼠空肠组织的冰冻切片—间接免疫荧光试验发现,RV 作用后肠组织结构有明显改变,HSC70主要分布在肠绒毛表面,同时通过肠组织形态及HSC70抗体在肠组织中表达情况可知,食淀粉乳杆菌对肠组织有一定的保护作用,且减少了HSC70在肠组织中的表达量。对乳鼠空肠组织中HSC70 mRNA 表达情况发现,每组的HSC70 m RNA 含量都有显著的增高,与ELISA 测定的蛋白结果变化相反,说明加入食淀粉乳杆菌后的乳鼠空肠中HSC70 mRNA 的翻译都不同程度的受到了阻碍,这导致HSC70的蛋白质含量降低,从而减少RV 与细胞的结合位点并发挥抗病毒能力。在m RNA 翻译成为蛋白质的过程可能受到核糖体、起始因子可溶性蛋白及tRNA 等因素的影响,因此探究食淀粉乳杆菌分泌上清中影响HSC70 m RNA 翻译的具体成分也成了继续研究的方向。综上所述,确定了食淀粉乳杆菌可以显著抑制HSC70在空肠组织中的含量以减少RV 对细胞的吸附位点,从而起到抗病毒作用,同时发现RV 与受体HSC70的结合主要发生在病毒入侵的后期,并且食淀粉乳杆菌可分泌某些成分在一定程度抑制乳鼠肠组织病毒受体HSC70 m RNA 的翻译。