龙云铸 贺萧瑾 李丹 周娟 周青 谭英征

肝细胞癌(HCC)是临床上常见的恶性肿瘤，我国HCC的发生与HBV感染关系密切[1]。HBV是由双链DNA构成的病毒，包含四个重叠的编码基因区域，其中，HBV X基因(HBx基因)可通过抑制抑癌基因的表达而导致HCC的发生[2]，但HBx基因发挥作用的具体机制仍不清楚。在多种抑癌基因中，细胞因子信号转导抑制蛋白-1(SOCS-1)基因发挥重要的调控作用，SOCS-1基因启动子区域甲基化可促进多种肿瘤细胞的增殖和转移[3]。我们推测HBx基因可能通过抑制SOCS-1基因表达而起作用。本研究主要利用细胞转染及甲基化PCR技术，探究HBx介导SOCS-1基因甲基化致HCC发生的机制。

资料与方法

一、材料

(一)细胞系 人正常肝细胞系L-02，购于通派生物科技有限公司。

(二)主要试剂 胎牛血清、MEM培养基(Gibco Life Technologies)；HBx质粒(上海吉玛制药有限公司)；MTT细胞活力检测试剂盒、SYBR Green qPCR Mix试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；Transwell小室(美国康宁公司)；RNA逆转录试剂盒、SOCS-1基因甲基化扩增试剂盒、引物序列合成(上海杰美基因医药科技有限公司)，见表1；小鼠抗人HBX单抗、小鼠抗人SOCS-1单抗、兔抗小鼠二抗(圣克鲁斯生物技术有限公司)。

(三)主要仪器 细胞培养箱(上海培因实验仪器有限公司)；酶标仪(Thermo Scientific MultiSkan Go)；实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。

二、方法

(一)细胞培养 将L-02细胞使用含10%胎牛血清的MEM培养基，放置在无菌培养箱中常规培养，培养温度为37 ℃，CO2浓度为5%，每4天传代一次。

(二)细胞分组及细胞转染 (1)细胞分组：在进行转染前，将培养在96孔板或6孔板的细胞分为对照组、空载质粒转染组、HBx质粒转染组。……