黄 静，李俊如，张 帅

四川省西昌市凉山彝族自治州第一人民医院检验科，四川西昌 615000

丙型肝炎病毒(HCV)的全球感染率达3%，其感染后引起的丙型病毒性肝炎为常见的感染性疾病，控制不佳还可发展为肝衰竭，严重影响患者健康。HCV感染1周内人体内就可检测出HCV-RNA，应用分子生物学技术定性检测HCV-RNA可用于HCV感染的早期诊断,解决了免疫学检测的“窗口期”问题。此外，定量检测HCV-RNA的拷贝数，对动态监测HCV的传染性、病毒复制情况、抗病毒药物疗效及判断患者预后等有着重要的临床意义[1]。因此，HCV-RNA检测结果的准确性显得尤为重要。临床PCR实验操作烦琐，影响检测结果的因素较多，为评估检测系统性能，保证检测结果准确，进一步完善实验室质量控制体系，本研究参照中国合格评定国家认可委员会(CNAS)-GL039[2]对HCV-RNA定量检测系统的准确度、精密度(重复性和中间精密度)和线性区间进行了分析验证，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 随机收集HCV感染者HCV-RNA水平为107、102IU/mL的血清标本(无溶血、脂血、黄疸)各15 mL，充分混匀后各取300 μL分装至灭菌EP管内，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2仪器与试剂 湖南圣湘生物科技有限公司生产的稀释用小牛血清；原卫生部临床检验中心第二次室间质评标本：1721、1722、1723、1724、1725；北京康彻思坦公司提供的HCV-RNA标准物质：103、104IU/mL的血清标本(批号：201708003、201706001)；核酸提取仪 (湖南圣湘，型号：S11A)；ABI公司生产的实时荧光定量PCR扩增仪(ABI75000，批号：275051447)；丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR荧光探针法)(湖南圣湘,批号：2017031)。

1.3方法

1.3.2线性验证 将HCV-RNA水平为107IU/mL的血清标本作为初始标本，用小牛血清依次以10倍水平梯度稀释至106、105、104、103、102IU/mL，稀释当天每份标本检测2次，计算每一水平实测值(为测量均值)，排除离群值。以稀释倍数为横轴,每个稀释倍数所对应的实测值为纵轴进行线性回归分析,求出回归方程Y=aX+b和相关系数的平方(R2)，如果R2>0.95，则可以初步判断厂家提供的线性范围符合要求。根据线性回归方程求出每一稀释倍数符合线性方程的理论值，计算每一稀释倍数实测值和理论值间的差异[4]，实测值与理论值均用对数形式表示。以能力验证/室间质评评价界限(靶值±2/5对数值)作为TEa[5]。

1.3.3准确度验证 检测室间质评标本1721、1722、1723、1724、1725，并将实测值与CANS认可的原卫生部临床检验中心提供的PT项目结果(HCV-RNA)进行对比，使用PT项目时应不少于5份[3]。以能力验证/室间质评评价界限(靶值±2/5对数值)作为TEa[5]。实测值与靶值均用对数形式表示。

1.4统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，建立线性回归方程判断线性范围是否符合要求。

2 结 果

2.1精密度验证 HCV-RNA 107、102IU/mL两水平标本的实验室内s分别为0.047 9、0.033 5，满足重复性<3/5TEa(0.24)的要求，见表1。HCV-RNA 103、104IU/mL两水平室内质控品2018年1-6月的s分别为0.09、0.09，满足中间精密度<4/5TEa(0.32)的要求，见表2。

表1 HCV-RNA重复性验证结果

2.2线性验证 线性回归方程为Y=-0.995 7X+ 8.376 7，R2=0.999 6，初步判断线性范围符合要求。每一稀释倍数实测值和理论值的差异均满足TEa要求，见表3。

表2 HCV-RNA中间精密度验证结果

表3 HCV-RNA线性验证结果

2.3准确度验证 将实测值与PT项目(HCV-RNA)结果进行对比，均满足TEa要求，见表4。

表4 准确度验证结果

3 讨 论

实时荧光定量PCR检测技术以其高灵敏度、高特异度、全封闭单管扩增等优势逐渐在各临床实验室中被广泛使用。目前尚无权威机构发布分子诊断相关的检验程序性能验证的具体解释和指导意见，为保证检测结果的准确、可靠，有大量文献进行了自建性能验证方法探讨[6-9]。2019年2月15日CNAS首次发布CNAS-GL039《分子诊断检验程序性能验证指南》[2]，本实验室依据CNAS-GL039标准对HCV-RNA定量检测系统的性能进行了分析验证。

线性是反映实验室方法性能的重要指标之一，可反映分析物水平或活性与分析检测系统之间相应的比例关系，在临床医生认为有价值的分析检测范围内实验方法呈线性，了解分析结果与真值之间的偏差，才能保证检测结果准确可靠。本研究HCV-RNA稀释倍数与实测值的线性回归方程为Y=-0.995 7X+8.376 7，R2>0.95，每一稀释倍数对应的实测值和计算理论值的差异均满足TEa要求，可以初步判断厂家提供的线性范围符合要求，满足临床需要。

基因扩增检测已被广泛应用于临床、科研工作，基因扩增检测受基质效应、基因变异等多种因素影响，各试剂厂家实验方法不同，因此检测灵敏度、特异度差异较大。分子诊断中很多实验缺乏参考方法，难于校准，因此实验室将室间质评作为室内质控的有效补充，目前是分子诊断质量保证中不可或缺的部分。本研究将此次验证检测的室间质评标本的结果与原卫生部临床检验中心的PT项目(HCV-RAN)结果对比，准确度满足能力验证要求。

综上所述，CNAS-GL039为分子实验室完善质量控制体系提供了切实可行的依据。根据CNAS-GL039对实验室HCV-RNA定量检测系统进行性能验证结果显示，该检测系统在一定范围内进行HCV-RNA检测的结果准确、重复性好，适用于临床实验室。