付锦雪,张晨星,王晓霞,刘志柏2，秦永建2,张梦棋,赵加瑞,赵昱舒,曹帮华,毛培利

(1.山东农业大学林学院，黄河下游森林培育国家林业和草原局重点实验室，山东泰山森林生态系统国家定位观测研究站，山东 泰安 271018；2.山东省费县国有塔山林场，山东 临沂 273400；3.山东省林木种苗和花卉站，山东 济南 250014)

种子萌发是森林生态系统天然更新的关键过程。水分胁迫是决定种子萌发的关键因子之一[1]。研究表明，随水分胁迫程度的增加，种子萌发可以归纳为2种类型：一是受到明显抑制[2-6]；二是轻度胁迫促进或没有显著降低，而重度胁迫显著抑制[7-9]。适度水分胁迫下促进种子萌发，是因为适当降低吸胀速度可以减少对种子膜的伤害，有利于种子膜系统的修复，防止由于快速吸水造成的细胞膜破裂和种子内部物质外渗[3,10,11]。种子大小也是影响种子萌发的重要因子。大种子比小种子不仅有着高的萌发能力和幼苗存活率[12-14]，而且在成年阶段有着高的繁殖能力[12]。有研究表明，大种子比小种子有着更强的在逆境下萌发的能力[15-17]，但也有研究认为，不同大小种子的萌发优势受到外界环境的胁迫程度影响[7,17]。

侧柏(Platycladusorientalis)耐干旱瘠薄、适应性强，是石质山地、干旱、半干旱地区荒山造林的重要树种和石灰岩山地造林的先锋树种[18]。随着林龄的增加和林分的老化，侧柏人工林的更新已成为经营管理中的重要研究内容。有研究表明，侧柏人工林具有一定的天然更新能力[19-21]。鲁法典等[19]认为，郁闭度是影响侧柏人工林下幼树生存、生长的首要因子。但王斐等[21]发现，侧柏幼苗大量着生于山地汇水面、水沟两侧以及山地沟谷两边，认为侧柏幼时喜光、喜湿润环境。种子特性是影响侧柏人工林天然更新的关键因子之一。张梦颖等[22]发现，海拔显著影响种子活力，在海拔300～500 m最高。柏斌斌等[23]发现，随母树径级的增加，侧柏种子的质量和幼苗生长能力显著提升。张泓景等[18]认为，温度和光照都是影响侧柏种子萌发的主要生态因子。吴夏明等[24]、盛升等[25]比较了不同种源侧柏的种子发芽能力。水分胁迫是限制侧柏人工林内种子萌发的重要因子。已有的研究发现，水分胁迫显著抑制了侧柏种子的萌发[24,26]，但种子大小对其萌发的影响还没有系统研究。本试验以山东省泰安市东平县石灰岩山地的侧柏人工林结实的种子为材料，研究水分胁迫和种子大小对其萌发的影响，阐明二者对其萌发的影响机制，为侧柏人工林的天然更新早期阶段的管理提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况

研究区域位于山东省泰安市东平县，所属区域属温带季风型大陆性气候，四季变化明显，雨热同季。年平均降雨量为609.16 mm，汛期降雨占全年降雨量的74%左右。受季风气候的影响，年际降水变化幅度比较大。年平均气温为12.9 ℃，无霜期200 d，年日照时数2 401.1 h。洪顶山为石灰岩山地，土层瘠薄，土壤保持水分能力差，土壤pH=7.72，全氮含量2.98 g·kg-1，全磷0.82 g·kg-1，水解性氮185.92 mg·kg-1，有效磷3.76 mg·kg-1，速效钾128.62 mg·kg-1，有机质50.48 g·kg-1。造林难度大。侧柏人工林为上世纪80年代初营造的纯林，大多为纯林，林下植被比较简单。

1.2 研究方法

1.2.1种子采集

2018年11月下旬，在山东省泰安市东平县洪顶山的侧柏人工林内采集球果。林分密度为1 850株·hm-2，平均树高6.09 m，平均胸径9.07 cm。球果风干开裂后收集饱满种子用于试验。用6目的土壤筛将收集的种子分为大粒(Ⅰ)和小粒(Ⅱ)2个等级。每个等级的侧柏种子均采用百粒法测定千粒重。在大粒种子和小粒种子中随机选出15粒种子，用游标卡尺测量种子的最大长度与最大宽度。

1.2.2种子萌发实验

将大粒和小粒种子放于不同PEG 6000浓度下进行萌发试验。PEG浓度(质量浓度)设置为0(0 MPa)、5.0%(-0.05 MPa)、10.0%(-0.15 MPa)、15.0%(-0.30 MPa)和20.0%(-0.49 MPa)。将大粒、小粒的种子用初始温度40 ℃的去离子水浸泡24 h，然后在浓度3‰的高锰酸钾溶液中浸泡10 min用于消毒。将消毒后的种子用去离子水洗涤直至去掉高锰酸钾，然后把种子摆入直径9 cm的培养皿中。培养皿及放于培养皿内的海绵垫、滤纸均已在高温灭菌锅内消毒。每个培养皿按照试验设计加入25 mL不同浓度的PEG溶液和摆放20粒侧柏种子，每个浓度的PEG重复3次，总共30个培养皿。种子摆盘后，将培养皿放入用70%的酒精消毒过的恒温培养箱中。培养箱的温度为25 ℃，湿度为43%，实验持续21 d。萌发过程中每24 h观测1次，每天向培养皿中加入等量去离子水以补充因蒸发而损失的水分。当胚根突破种皮时，即视为种子萌发，并记录种子萌发的起始时间和每日萌发种子数量。

实验结束后，将培养皿内萌发的幼苗分为地下和地上两部分，每盘选取平均长势的2株幼苗。用HP Scanjet 8200扫描仪扫描根系，然后用Delta-T Area Meter Type AMB2根系参数分析软件分析扫描图片获取根长(Root length，RL)、根系表面积(Root surface area，RSA)、根系直径(Root diameter，RD)和根体积(Root volume，RV)。用直尺测量幼苗的胚芽长(Germ length，GL)和胚根长(Radicle length，RAL)。计算种子的发芽率(Germination rate，Gr)、平均发芽时间(Mean germination time，MGT)、发芽指数(Germination index，Gi)和活力指数(Vigor index，Vi)。

Gr=(G1/N)×100%;

式中：G1为种子萌发粒数，N为供试侧柏种子总粒数;

MGT=(∑D×n)/∑n;

式中：D为从种子置床起的天数，n为相应各日正常发芽的种子粒数;

Gi=∑(Gt/Dt);

式中：Gt为各日净发芽数，Dt为相应发芽日；

Vi=Gi×S;

式中：Gi为发芽指数，S为胚根长。

培养皿中未萌发的侧柏种子用红四氮唑(TTC)法进行种子的活力测定。TTC溶液浓度为0.1%，将未萌发的侧柏种子横切，取其中的一半放入干净的培养皿中，另一半种子备用。向培养皿中加入TTC溶液，以浸没种子为宜，然后放入30 ℃的恒温箱中3 h。显色时间一到，倒出TTC溶液，并用自来水冲洗2～3次，观察胚的着色情况，根据是否变红来判断种子的生活力。计算休眠种子的百分率。

1.3 统计分析

所有的数据采用SPSS 17.0软件(SPSS，Chicago，IL，USA)进行分析。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)比较侧柏种子的千粒重、最大宽、最大长。用双因素方差分析比较了发芽率、休眠率。由于侧柏种子在20%PEG下发芽率为0，因此用双因子方差分析(Two-Way ANOVA)比较了ck到15%PEG浓度下的平均发芽时间、发芽指数、活力指数、胚芽长等指标的差异。由于侧柏小种子在15%PEG下根长、根表面积、根体积和根平均直径为0，故用双因子方差分析比较了ck到10%PEG下的差异。如果差异显著，采用最小显著差异法(LSD)进行多重比较。同时，将种子萌发和幼苗生长指标利用Pearson Correlation Coefficient法进行了相关分析。分析时显著性差异检验水平为p<0.05。

2 结果与分析

2.1 不同等级的种子大小比较

方差分析结果表明，不同大小侧柏的种子之间在千粒重(F=41.71,p<0.01)和最大宽度(F=9.85,p<0.01)上差异极显著，在最大长度上差异显著(F=5.19,p<0.05)，以上指标均是Ⅰ>Ⅱ(表1)。

表1 不同等级大小的种子特征

注：不同字母表示差异显著，小写字母表示检验水平为p<0.05，大写字母表示为p<0.01水平。

2.2 水分胁迫和种子大小对种子萌发和休眠的影响

2.2.1种子萌发

PEG浓度对发芽率、发芽指数、活力指数和平均发芽时间都有着极显著影响(表2)。随着PEG浓度的增加，侧柏种子的发芽率、发芽指数和活力指数逐渐降低，平均发芽时间逐渐增加(图1)。发芽率在ck与5%PEG浓度下差异不显著(p>0.05)，显著高于其他胁迫处理(p<0.01)，在20%PEG浓度下为0；发芽指数和活力指数上均是ck时最大(p<0.01)，而平均发芽时间上则是ck时最小(p<0.01)。种子大小对发芽率、发芽指数和活力指数有着极显著影响，对平均发芽时间影响不显著(表2)，上述指标均是大粒种子高于小粒种子。在15%PEG下，大种子的发芽率为10%，而小种子发芽率仅为2.5%。PEG浓度与种子大小对发芽率、发芽指数和活力指数都有着极显著的交互影响，PEG浓度越小，大种子的上述指标比小种子的越大；但在平均发芽时间上交互作用不显著(表2，图2)。

2.2.2种子休眠和死亡

PEG浓度对种子休眠有着极显著影响，但种子大小影响不显著，二者没有显著的交互作用(表2)。随着PEG浓度的增加，种子休眠率逐渐显著增加(图2)。休眠率在ck下与5%PEG差异不显著(p>0.05)，显著小于10%(p<0.05)，ck、5%和10%PEG极显著小于15%和20%PEG下的处理结果(p<0.01)。

PEG浓度和种子大小对死亡率有着显著影响，二者有着显著的交互作用(表2)。随着PEG浓度的增加，死亡率先降低再增加，在10%和15%PEG最低(图2)，平均死亡率为42.24%。大种子比小种子有着低的死亡率，而且随着PEG浓度的降低，小种子的死亡率比大种子增加更明显(图2)。

图1 水分胁迫和种子大小对侧柏种子萌发的影响

图2 水分胁迫和种子大小对侧柏种子休眠率和死亡率的影响

2.3 幼苗大小

PEG浓度对胚根长、胚芽长、胚芽长/胚根长都有着极显著影响(表2)。随着PEG浓度的增加，胚根长、胚芽长逐渐降低，在15%PEG时已经接近0，胚根和胚芽接近停止生长；胚芽长/胚根长则呈波浪形降低(图3)。种子大小对胚根和胚芽长/胚根长没有显著影响，对胚芽长影响显著(表2)，大种子的胚芽长显著大于小种子的。PEG浓度与种子大小对胚根长、胚芽长、胚芽长/胚根长都有着极显著的交互影响，PEG浓度越小，大种子的上述指标比小种子的越大(表2，图3)。

表2 PEG浓度和种子大小对侧柏种子萌发和幼苗指标的双因子方差分析结果

图3 水分胁迫和种子大小对侧柏幼苗大小的影响

表3 侧柏种子萌发和幼苗生长指标之间相关分析

注：*表示达到显著水平(p<0.05)；**表示达到极显著水平(p<0.01)。

2.4 水分胁迫和种子大小对幼苗根系形态的影响

PEG浓度对根长、根表面积有着极显著影响，对根体积有着显著影响，对根直径没有显著影响(表2)。随PEG浓度的增加，根长、根表面积和根体积逐渐降低(图4)。种子大小对根长、根表面积、根平均直径没有显著影响，对根体积影响显著(表2)，大种子的根体积显著大于小种子的。PEG浓度与种子大小对根长、根表面积、根平均直径没有显著的交互影响，对根体积影响显著(表2)。随着PEG浓度的降低，大种子的根体积比小种子的越大(图4)。

2.5 种子萌发和幼苗生长指标之间相关分析

由表3可以看出，胚根长和胚芽长都与Gr、Vi、Gi成极显著正相关，与MGT成极显著负相关；与RL、RSA、RV(除胚根长与RV成显著正相关)成极显著正相关。发芽指标Gr、MGT、Vi和Gi与根系形态指标RL、RSA和RV两两之间有着极显著或显著相关性，其中MGT与上述指标之间成极显著负相关，其他指标之间为极显著或显著正相关。侧柏种子的萌发指标之间，发芽率、发芽指数和活力指数之间成极显著正相关，三者均与平均发芽时间为极显著负相关。幼苗根系特征之间，RL与RSA成极显著正相关，与RV成显著正相关，RSA与RV成显著正相关。

3 讨 论

水分吸收是种子萌发的重要步骤，分为吸胀吸水、缓慢吸水和生长吸水3个阶段[27]。随PEG浓度的增加，侧柏种子的发芽率、发芽指数、活力指数逐渐降低，平均发芽时间逐渐增加，这在樟子松[2]、木麻黄[6]、达乌里胡枝子[9]、大豆[4]上都有相似的结果。种子萌发受到抑制与水分胁迫下种子的吸水量下降、吸水速率降低，抑制了种子萌发的生理生化反应进程有关[1]。本研究发现，在20%PEG浓度下发芽率为0，表明侧柏种子发芽的极限不超过20%PEG，与吴夏明等[24]、刘延惠[26]的研究结果一致。侧柏种子的休眠率随PEG浓度的增加逐渐增加。在干旱胁迫等逆境下种子休眠率增加[28]，等待适宜的环境再萌发是适应环境的表现[7,17]。侧柏种子的死亡率在轻度水分胁迫下最高，与白刺花种子相似[7]。本试验发现在水分胁迫下侧柏种子平均死亡率为42.24%，死亡率较高。侧柏人工林多分布在干旱缺水的山地，长期的干旱胁迫限制了种子萌发，同时加剧了种子的死亡，这可能是其早期更新困难的重要原因。

图4 水分胁迫和种子大小对侧柏幼苗根系形态的影响

随PEG浓度的增加，侧柏幼苗的胚根长、胚芽长、胚芽长/胚根长都是极显著降低，幼苗的生长受到显著抑制，与水分吸收受到抑制有关[1-2]。这在达乌里胡枝子[9]、樟子松[2]上也有类似发现。胚芽长/胚根长的降低表明侧柏幼苗在干旱胁迫下对根系的投入要高于对地上部分，是对水分胁迫的一种适应，与樟子松结果一致[2]。但木麻黄水分胁迫下的胚根长没有显著变化[6]。在根系特征上，随PEG浓度的增加，侧柏幼苗的根长、根表面积、根体积降低，这表明根系的形态发育显著受到了水分胁迫的抑制，与大豆的表现一致[4]。但油菜在水分胁迫下根系发育没有受到显著抑制[29]。朱教君等[2]认为，根系发育在水分胁迫下受到抑制，严重影响了根系的吸收水分能力。相关分析表明，胚根长和胚芽长与种子萌发指标极显著相关，表明种子萌发进程决定了幼苗的生长，这对预测早期更新具有重要意义。同时，胚根长和胚芽长还与RL、RSA、RV成极显著正相关。Mao et al.[14]发现，根系发育程度与幼苗的大小成显著正相关。因此，根系发育受到显著抑制是侧柏幼苗个体减小的重要原因。

大种子比小种子在种子萌发和幼苗个体大小上有显著优势。本研究发现，侧柏大种子比小种子有着高的发芽率、发芽指数、活力指数，大的胚芽长和根体积，与黑松种子萌发[14]的结果一致。侧柏大种子在15%PEG浓度下还有10%的发芽率，而小种子则发芽率为2.5%。柠条锦鸡儿在沙埋深度超过8 cm时比中小种子有着高的发芽率[30]。Zhao等也发现，白刺花50%最大发芽率时大种子的水势为-0.836 MPa，低于中种子的-0.786 MPa和小种子的-0.812 MPa[17]。这些研究表明大种子比小种子在逆境下有更强的竞争能力。在死亡率上，侧柏大种子显著低于小种子。在Dithyrea californica也有相似发现，这可能与大种子养分含量高有关[12]。另外，本研究发现，种子大小与水分胁迫对种子萌发有着显著的交互作用，体现在随着胁迫程度越低，大种子比小种子有更高的发芽能力，低的种子死亡率，大的幼苗个体，这表明轻度胁迫或没有胁迫的环境更有利于大种子萌发。这与王斐等[21]发现的侧柏幼苗大量着生于山地汇水面、水沟两侧以及山地沟谷两边较湿润的环境结论一致。对白刺花种子在干旱胁迫下的发芽、休眠和死亡的研究发现，顺境有利于大、小种子萌发和小种子休眠，中度干扰有利于中等种子萌发、大种子休眠，增加小种子死亡风险，逆境会增加大种子死亡风险、中等种子和小种子休眠[7,17]。因此，种子大小在逆境下的调节作用对早期更新有着重要影响。

4 结 论

综上所述，水分胁迫和种子大小以及二者的交互作用是影响侧柏种子萌发的重要机制。随着PEG浓度的增加，种子萌发受到显著抑制，发芽时间变长，发芽的临界阈值不超过20%PEG；幼苗变小，根系发育缓慢，但对根系的投入显著增加，对水分胁迫有着一定的适应能力。水分胁迫使得侧柏种子的休眠率显著增加，最高可达46.67%。同时水分胁迫还会造成侧柏种子的死亡，平均死亡率为42.24%，死亡率较高。侧柏人工林多分布在石质山地、干旱、半干旱地区的荒山上，在长期干旱下低发芽率和高死亡率是限制其种子萌发的重要原因。大种子比小种子在水分胁迫下的死亡率较低，高的发芽能力、胚芽长和根体积，在抗逆和萌发上有着优势。PEG浓度越低，在萌发和幼苗大小方面大种子比小种子优势越明显，在较湿润环境下更有利于大种子萌发和幼苗生长。因此，种子大小对水分胁迫的调节对侧柏人工林的早期更新有着重要意义。在今后的研究中，需要加强种子大小与环境因子的协同作用研究，这将有利于找出侧柏人工林天然更新的限制机制。