[山东第一医科大学（山东省医学科学院），山东 泰安 271016]

先天性心脏病（congenital heart disease,CHD）作为病因未明的多基因遗传病，发病率逐年上升，给家庭与社会带来巨大的经济负担[1-4]。TBX5属于T-box基因家族一员[5-7]，与心脏正常发育有关[8-9]。研究表明，基因3'非翻译区受microRNA（miRNA）靶向调控，miRNAs 靶序列单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）可通过影响靶基因表达水平进而影响个体对疾病的易感性。但关于TBX53'非翻译区SNP与CHD的相关性研究尚不多见。本研究对TBX53'非翻译区SNP与CHD 易感性的关系进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年12月—2015年5月在山东大学齐鲁儿童医院就诊的186例部分单纯CHD患儿（病例组）。所有病例经临床诊断、心脏彩超诊断、X 射线或CT 影像检查（优先考虑前两个诊断），且排除心血管之外的畸形和无家族遗传史的非综合征CHD患儿。所有对照为本院同期儿童保健科就诊的200例健康体检儿童（对照组），均排除遗传性疾病。

1.2 方法

1.2.1 标签SNP的选取 ①获取TBX5基因及区域内的SNP 信息：首先从GenBank 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）获取人类TBX5基因的染色体位置及序列信息，之后从HapMap 数据库（http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/）选 择Project Data HapMap Genome Browser release #28（phases 1,2 & 3-merged genotypes & frequencies）获得中国北京汉族人中TBX5基因SNP位点的基因型数据；②将获得的中国北京汉族人群中TBX5基因所有SNP位点基因型数据分别导入Haploview 4.2，找出最小等位基因频率（minor allele frequency,MAF）≥5%的常见SNP，计算各个基因内SNP位点间的连锁不平衡（linkage disequilibrium,LD）程度数据（r2值），根据r2值大小构建Block 图谱并筛选具有代表性的标签SNP位点；③标签SNP 选择：根据列出每个单倍域内r2≥0.8的SNP，然后选出与Block 内其余SNP 之间r2≥0.8个数最多，且r2平均值最大一个位于3'非翻译区的SNP作为标签SNP，如若同时有多个SNP 符合条件，则结合本次研究目的优先考虑3'非翻译区的标签SNP。

1.2.2TBX5基因3'UTR qPCR-HRM 扩增 提取研究对象外周静脉血基因组DNA，通过查询NCBI GenBank 获得TBX5基因3'非翻译区原始序列，并以此为基础，利用在线Primer 5.0软件设计高分辨率熔解曲线所需引物，在LightCycler® 96 荧光定量PCR仪（瑞士罗氏公司）上进行扩增。反应体系总体积10μl：基因组DNA 1μl，Mg2+1.6μl，高分辨率熔解曲 线（high resolution melting analysis,HRM）Master Mix 10μl，正、反向引物各1μl，双蒸水5.4μl。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，65℃退火15 s，60℃延伸15 s，45个循环。HRM分析：95℃预变性1 min，40℃变性1 min，65℃退火1 s，65℃～97℃（0.07℃/s），37℃冷却30 s。反应结束后，通过LightCycler® 96软件中的High Resolution Melting模块对结果进行分析，基因分型。

1.2.3 PCR 产物测序 随机选取利用HRM 成功分型的TBX5基因rs883079位点3个基因型G/G、G/A及A/A 各10个样本，应用Sanger双脱氧链终止法进行测序，测序结果与HRM分型结果进行比对。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 24.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验，计算基因各个多态性位点的基因型频率和等位基因频率；运用Hardy-Weinberg平衡在线检测程序检验研究样本是否具有群体代表性；比值比（odds ratio,OR）及其95% CI 以非条件Logistic 回归分析计算，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组性别、年龄比较

两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 标签SNP 筛选

根据基因内SNP 之间连锁不平衡程度，采用HaploView软件构建TBX5基因SNP间的Block图。HaploView软件运行结果显示，TBX5基因内共构成 5个Block，且结果只有SNP rs883079 符合预设筛选3'非翻译区标签SNP 条件。见图1。

2.3 TBX5 等位基因分型结果

以经过测序的野生型DNA 样品作为标准品，HRM分析检测TBX5基因目的片段。选取HRM 3种分型样品进行测序验证，测序峰图证实TBX5基因3'非翻译区rs883079位点存在3种基因型，且与HRM结果一致。见图2、3。

图1 TBX5基因构建Block

2.4 TBX5基因多态位点各基因型分布Hardy-Weinberg平衡检测比较

图2 qPCR-HRM 基因分型

TBX5基因多态位点各基因型分布Hardy-Weinberg平衡检测比较，差异无统计学意义（χ2=0.378，P=0.539）。TBX5基因rs883079（G＞A）基因型在对照组中分布符合Hardy-Weinberg平衡，可认为对照组人群来自总体人群，不存在选择性偏倚，具有群体代表性。见表1。

2.5 两组TBX5 等位基因频率分布比较

两组TBX5等位基因频率分布比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。突变等位基因A 为CHD的危险性基因（P＜0.05）；携带A/A 基因型的个体相对于携带G/G 基因型者患CHD的危险性增加，提示A/A 可能为CHDs的危险基因型。见表2。

2.6 TBX5基因多态性与不同类型CHD的关系

图3 TBX5基因rs883079位点3种基因型测序图

表1 TBX5基因多态位点各基因型分布Hardy-Weinberg平衡检测比较 %

按照CHD 具体表型分层，对TBX5基因标签SNP rs883079 进行分析发现，尽管rs883079 突变纯合子A/A 基因型与CHD 易感性相关，但其风险程度在不同类型的CHD 中仍有差异。TBX5基因rs883079（G＞A）位点中，以携带G/G 野生纯合子基因型者为对照，携带突变纯合子基因型A/A的个体患间隔缺损的危险性升高。对于室间隔缺损患儿，以携带G/G 野生纯合子基因型者为对照，TBX5基因rs883079 多态，G/A 基因型、A/A 基因型或是G/A+A/A 基因型均未见该位点与室间隔缺损有统计学关联。对于房间隔缺损患儿，以携带G/G 野生纯合子基因型者为对照，TBX5基因rs883079 多态无论是A/A 基因型或是G/A+A/A 基因型都与CHD 风险相关（P＜0.05）。提示TBX5的该非编码区多态主要与CHD 房间隔缺损相关，或是其危险因素。见表3。

表2 SNP位点等位基因和基因型在病例组和对照组中的分布

表3 TBX5基因多态性与不同类型CHD的关系

3 讨论

随着分子遗传学的发展，CHD 遗传因素的作用受到了越来越多的重视。心脏发育相关的转录因子在CHD 发病机制中的重要作用已在一些生物模式中得到证实。与心脏发育密切相关的转录因子异常可导致严重的CHD。TBX5是心脏早期发育过程中极为重要的转录因子之一，能通过与另外2个转录因子GATA4、NKX2-5在基因和蛋白水平上相互作用，调节心室特化、房室分隔等一系列心脏发育过程[10]。

SNP与疾病易感性的研究已广泛报道[11]。CHD与SNP 遗传多态性的研究是近年来CHD 病因研究的热点与重点之一。已有研究发现，一些位于TBX5基因SNP 同心脏相关疾病有关。LIU 等[12]对192例中国汉族室间隔缺损患儿研究结果显示，在TBX5基因找到与室间隔缺损易感SNP（rs11067075）。SINNER 等[13]对心房颤动患者研究发现，TBX5基因rs10507248 多态与心房颤动有关。王凤等[14-15]对室间隔缺损患儿和健康对照的TBX5基因3'非翻译区相关SNP 进行基因分型和关联分析，结果显示TBX5基因3'非翻译区rs6489956（C＞T）多态位点可增加室间隔缺损的发病风险，功能研究发现T 等位基因能增强miR-9和miR-30a的负向调控，导致TBX5基因的表达差异。

本研究测序验证发现，与HRM 结果一致。笔者基于病例对照研究设计，依据基因分型结果探讨rs6489956（C＞T）位点SNP与CHD的关联，该位点基因型在两组分布比较有差异。笔者依据CHD的具体表型进行分层分析，发现对于房间隔缺损患儿，TBX5基因rs883079 多态性A/A 基因型或是G/A+A/A基因型相对于G/G 野生纯合子基因型者有增加CHD发病的风险，未发现该位点多态性与室间隔缺损之间的关联，猜测TBX5rs883079位点SNP 可能是CHD房间隔缺损的危险因素。

有证据显示，TBX5基因rs883079位点与心脏生理活动有关。一项GWAS 研究发现，该位点与QRS时限和心室传导有关[16]。PAZOKI 等[17]在心室颤动的一项研究中也表明该位点与心电图QRS 时限相关。POLYMIRTS 数据库预测当多态性位点rs883079 等位基因为G 时，只有hsa-miR-132-5p 可能靶向结合该区域，当等位基因为A 时，包括hsa-miR-1231在内的11个miRNA 可能靶向结合[18-19]。因此，当rs883079位点等位基因发生改变时，可能会影响这些miRNA的靶向调控，引起TBX5基因在翻译水平的改变，从而影响心脏发育，导致CHD的发生。有关TBX5基因rs883079位点SNP与CHD，特别是室间隔缺损关系的分子机制还有待进一步行分子实验来验证。