梁田田，李日恒，张爱民，郑三龙，丁丽坤，彭鑫宇，问明，郗欣，郭剑，王伟森，李杰

（1.河北大学，河北 保定，071002；2.河北大学附属医院，河北 保定 071000；3.保定涞源县医院，河北 涞源 074300）

结直肠癌是世界范围内常见的一种癌症。2012年全球癌症数据统计，结直肠癌发病率在男性恶性肿瘤中排第3位，女性中排第2位，死亡率高达49%[1]。

孕酮及脂联素受体3（progestin and adipoQ receptor 3,PAQR3）参与细胞信号传导、能量代谢及细胞分裂分化等多种生物学过程。近年来研究发现，PAQR3在食管癌、喉鳞状细胞癌及脑胶质瘤等多种肿瘤中发挥抑癌作用[2-4]。普鲁卡因作为局部麻醉药物对结直肠癌细胞中PAQR3基因表达的研究报道 较少。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料与试剂 人结肠癌细胞株SW620、SW480、COLO205，胎牛血清（美国Gemini公司），L-15、RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），普鲁卡因（日本TCT公司），RT-PCR 试剂盒（日本TaKaRa公司）、EpiTect MSP 试剂盒（德国Qiagen公司），兔抗人PAQR3 抗体、辣根酶标记羊抗兔IgG 抗体等均购自石家庄华沃科瑞生物公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.2 仪器与设备 全波长酶标仪（美国EPOCH 基因有限公司），ChampGel 5000 全自动凝胶成像仪（中国容智创业），7300 实时荧光定量PCR仪、Veriti 普通PCR仪（美国Applied Biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及药物处理 人结肠癌细胞株SW620培养于L-15 完全培养基，置于低二氧化碳CO2培养箱。人结肠癌细胞株SW480、COLO205培养于RPMI 1640 完全培养基，置于5% CO2培养箱。将SW480细胞以5.0×105个/100 mm2的浓度接种于培养皿中，随机标记为对照组和实验组：对照组用RPMI 1640 完全培养基继续培养，实验组分别用0.5、1.0、2.0、5.0及10.0 mmol/L 不同浓度的普鲁卡因处理细胞。普鲁卡因溶于RPMI 1640 完全培养基中，对照组和实验组继续培养48 h。

1.2.2 实时聚合酶链反应（RT-PCR）使用日本TaKaRa 株式会社SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒，7300 实时荧光定量PCR仪进行聚合酶链反应。引物序列查阅文献[5]设计PAQR3 引物，正向引物：5′-TCTGTATGCTTTGCTCTGTGGG-3′；反向引物：5′-TTTGCCATTGCTGCGTGAG-3′，长度252 bp。内参基因为β-actin，正向引物：5′-GTGGACAT CCGCAAAGAC-3′；反向引物：5′-AAAGGGTGTA ACGCAACTAA-3′，长度302 bp。记录△Ct 值进行分析。

1.2.3 甲基化特异性聚合酶链反应（methylationspecific PCR,MSP）依据EpiTect MSP试剂盒说明书，以PAQR3 特异性甲基化及非甲基化 引物进行扩增。甲基化正向引物：5′-TTGTTGAAGA GCGCGTATTATATC-3′；反向引物：5′-TAAAAA CCCGAAAATCTACTCGTA-3′，长度109 bp。非甲 基化正向引物：5 ′ -TTGTTGAAGAGTGTGTATT ATATTGA-3′；反向引物：5′-TAAAAAACCCAAAA ATCTACTCATA-3′，产物长度109 bp。扩增完成后，对产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，全自动凝胶成像 仪分析结果。甲基化百分比=甲基化条带光密度值/（甲基化条带光密度值+非甲基化条带光密度值）×100%。

1.2.4 Western blotting 收集对照组及实验组的细胞，按RIPA 法提取细胞总蛋白；Bradford 法测定蛋白浓度，定量上样后电泳，转膜后封闭1 h。加入一抗，4℃过夜，TTBS 漂洗，二抗37℃孵育1 h，TTBS 漂洗，ECL 发光，C-DIGIT 印迹扫描器扫描，Image Studio Didits 系统分析。

1.2.5 药物处理及MSP 将结肠癌细胞接种于培养皿中，培养24 h，2 mmol/L 普鲁卡因处理细胞24 h后，进行MSP 反应。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用SNK-q法；计数资料以百分比（%）表示，比较用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PAQR3 mRNA在结肠癌细胞株中的表达

RT-PCR 结果显示，PAQR3在结肠癌细胞株中呈低表达。3种结肠癌细胞株中（SW480、COLO205及SW620）PAQR3 mRNA分 别 为（7.68±0.20）、（8.62±0.37）和（14.14±0.56），经方差分析，差异有统计学意义（F=458.391，P=0.000），SW620表达量高于COLO205和SW480（P＜0.05）。见图1。

图1 不同结肠癌细胞中PAQR3 mRNA的表达（±s）

2.2 PAQR3基因启动子在结直肠癌细胞株中的甲基化程度

MSP 检测结果显示，SW480、COLO205及SW620细胞株可见甲基化特异性扩增产物条带（见图2）。SW480、COLO205及SW620细胞株甲基化条带光密度值比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。SW480、COLO205及SW620 细 胞 株 中PAQR3基因甲基化百分比比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；SW480和COLO205细胞中PAQR3甲基化百分比较SW620细胞低（P＜0.05）。见表1。

图2 PAQR3基因启动子甲基化状态

表1 3种结肠癌细胞株中PAQR3基因甲基化比较

2.3 普鲁卡因处理后3种结直肠癌细胞株中PAQR3甲基化程度

MSP 显示，SW480、COLO205及SW620细胞株可见甲基化特异性扩增产物条带和非甲基化特异性扩增条带（见图3）。普鲁卡因处理后，对照组和实验组3种细胞株中PAQR3甲基化百分比比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组较对照组PAQR3甲基化百分比降低（P＜0.05）。见表2。

图3 对照组和实验组PAQR3基因启动子甲基化状态

表2 对照组与实验组3种细胞中PAQR3甲基化 比较 %

2.4 不同浓度普鲁卡因处理SW480细胞后PAQR3 蛋白的表达

Western blotting 检测结果显示，各组PAQR3 蛋白表达情况（见图4）。对照组、0.5 mmol/L 实验组、1 mmol/L 实验组、2 mmol/L 实验组、5 mmol/L实验组及10 mmol/L 实验组结肠癌细胞中PAQR3 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，实验组中PAQR3 蛋白相对表达量增加（P＜0.05）。见表3。

图4 普鲁卡因对PAQR3 蛋白表达的影响（±s）

表3 各组细胞中PAQR3 蛋白相对表达量比较（n =3，±s）

表3 各组细胞中PAQR3 蛋白相对表达量比较（n =3，±s）

组别 PAQR3 蛋白对照组 0.217±0.032 0.5 mmol/L 实验组 0.350±0.060 1.0 mmol/L 实验组 0.533±0.061 2.0 mmol/L 实验组 1.240±0.120 5.0 mmol/L 实验组 0.753±0.130 10.0 mmol/L 实验组 0.620±0.085 F 值 49.424 P 值 0.000

3 讨论

近年来，基因甲基化的研究成为热点。SHALABY等[6]发现，大肠癌患者血液和组织中MGMT和ERCC1甲基化频率高于良性肿瘤者，且MGMT和ERCC1基因甲基化与其mRNA表达下调有关。KATZENMAIER等[7]分析9种大肠癌细胞系中调控半乳糖凝集素表达的表观遗传学机制，发现在未分化的大肠癌细胞系中半乳糖凝集素-12的表达缺失和其启动子区高甲基化有关。此外，国内学者通过检测结肠癌组织中SFRP2启动子甲基化状态，也证实启动子CpG位点甲基化水平与结直肠癌的临床及病理特点有相关性[8]。国内外学者的研究都证实，基因甲基化在结直肠癌的发生、发展及预后中起重要作用。

PAQR3在多种肿瘤组织及细胞中表达降低，而过表达则可抑制肿瘤细胞的侵袭表型，提示PAQR3在肿瘤的发生、发展中发挥抑癌基因的作用[2-4]。近期研究发现，PAQR3在前列腺癌、乳腺癌等肿瘤组织出现基因甲基化，而这可能与PAQR3表达沉默相 关[9-10]。本实验组前期检测结直肠癌组织及癌旁组织中PAQR3的表达水平及甲基化状态[5]，与上述研究结论一致[9-10]。本实验发现，PAQR3在3种结直肠癌细胞株中呈低表达状态；在3种结直肠癌细胞中同样发现PAQR3 呈现甲基化状态。随后笔者又用普鲁卡因进行逆甲基化实验，发现在其浓度为2 mmol/L 时，可上调PAQR3 蛋白相对表达量。最后以最佳浓度普鲁卡因处理3种结直肠癌细胞发现，PAQR3在3种细胞株中甲基化率降低。通过实验笔者发现，PAQR3甲基化是其在结直肠癌中表达沉默的重要因素，而普鲁卡因可以逆转甲基化，上调结直肠癌细胞株中PAQR3蛋白相对表达。

综上所述，PAQR3甲基化在结直肠癌发生、发展中起重要作用。而普鲁卡因可以逆转PAQR3甲基化，上调PAQR3 蛋白的表达。