苏文华 汤海青 欧昌荣 高亚文 张梦思 李亚敏 昝春兰

(1宁波大学海洋学院,浙江 宁波 315211;2浙江医药高等专科学校食品学院,浙江 宁波 315100)

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)肉质细嫩,味道鲜美,深受消费者喜爱[1]。近年来,大黄鱼产量不断上升,2016 年产量已达到16.55 万t[2]。大黄鱼肉具有高水分、高蛋白和高脂肪的特点,在贮藏过程中易腐败变质,造成严重的经济损失[3]。冷藏是大黄鱼销售环节、贮藏过程中减缓腐败变质的有效方法之一,但冷藏过程中内源酶仍有活性,鱼肉中部分蛋白质和不饱和脂肪酸在低温下会发生氧化,降低大黄鱼营养、经济价值[4]。且市场上以冻藏、长时间冷藏的水产品冒充新鲜水产品的现象屡见不鲜,普通消费者难以通过直观鉴别。

鲜度是决定鱼类品质的重要指标之一,传统的评价方法主要有感官、微生物、理化检测等[5-7],但上述评价方法对检测人员专业要求高,且操作繁琐、难以实现实时检测[8-10]。近年来,红外[11]、拉曼[12]、高光谱成像[13]等光谱技术已被应用于水产品鲜度的快速无损检测,其中红外光谱的应用最为广泛,但其对较高含水量鱼类的定性分析精度不高[14],主要是由于水产品中含有较强的内源性荧光发色基团[15],在贮藏、加工过程中,发色基团会随水产品组织结构及生化特性的改变而发生变化。近年来,有研究者利用前表面荧光技术(front-face fluorescence spectroscopy,FFFS)检测内源荧光强度的变化,从而实现了对水产品鲜度的评价。如,Karoui 等[16]利用前表面荧光光谱法结合主成分分析,发现新鲜和冻融鳕鱼之间有较明显的区别;Hassoun 等[17]利用前表面荧光光谱法研究了不同储存条件下鳕鱼的鲜度变化,发现色氨酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)的荧光强度与硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substance,TBARS)呈良好的相关性。与传统荧光光谱法相比,前表面荧光光谱技术样品处理简单、检测速度快、灵敏度高,可用于分析粉末状、不透明的样品[18]。但是前表面荧光光谱法在水产品鲜度评价方面的研究还不够深入。为此本研究通过前表面荧光光谱法结合化学计量学技术对不同冷藏时间的大黄鱼进行分析,并运用偏最小二乘回归(partical least squares regression,PLSR)模型对大黄鱼的冷藏时间进行预测,以期为前表面荧光光谱在水产品鲜度评价中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品前处理

鲜活大黄鱼购自宁波市水产批发市场,重450±50.0 g,体长35±5.0 cm,随机选取50 尾,充氧运回实验室后冰击致死。将背部肌肉均匀分割成3 cm×2 cm×1 cm 的小块,分装于聚乙烯保鲜袋中,4℃冷藏。新鲜样品20 个,经不同冷藏时间处理的样品每组10 个,分别于第0、第3、第5、第8 天进行分析。

1.2 前表面荧光光谱数据采集

荧光光谱利用Horiba 公司的Fluoromax-4 荧光光谱仪测定。准确称取0.50 g 肉样,置于固体支架配件中,调整入射角度为56°。检测参数:激发光源为150 W 氙弧灯;激发波长和发射波长的狭缝宽度均为1 nm;响应时间设为自动;扫描光谱进行仪器的自动校正;色氨酸残基和NADH 激发波长分别为290 和340 nm,发射光谱分别为305 ～400 和360 ～600 nm。色氨酸和NADH 的荧光光谱数据各测50 组。

1.3 光谱数据归一化处理

为消除光谱采集中操作方法对数据的干扰,减少光散射效应,参照Bertrand 等[19]的方法,对光谱数据进行归一化处理。公式如下:

式中,N为每条光谱的数据点数;Ci为i波长下的归一化值;Li为i波长下的荧光强度。

1.4 回归模型的建立

PLSR 是光谱分析中使用最多的一种建模方法[20]。试验共有4 种处理样本,每种处理样本各随机抽取3 个作为预测集,其余样本作为建模集,建模集样本共38 个,预测集样本共12 个。建模集样本的平均光谱和鱼肉冷藏时间用PLSR 建模,模型再对预测集样本的冷藏时间进行预测。

1.5 数据处理

采用SPSS 19.0 软件进行主成分分析(principal component analysis,PCA),Fisher 线性判别分析(fisher linear discriminant analysis,FLDA)和偏最小二乘回归(PLSR),前两种方法根据各自不同的原理对样品进行分类,后一种方法是采用数据降维、信息综合与筛选技术,提取对系统最佳解释能力的新综合成分,消除多个变量之间的共线性,最大化自变量与因变量之间的共线性,从而建立回归模型。使用Orgin 8.5 软件作图。

2 结果与分析

2.1 荧光光谱分析

光谱归一化是将光谱统一到相同尺度进行数据分析的方法[21]。为消除光谱采集中操作方法对测定数据的干扰,提高仪器灵敏度,增强样品之间的差异性,对光谱数据进行归一化处理。由图1-A 可知,新鲜大黄鱼色氨酸发射光谱的最大发射波长在330 nm 处,冷藏大黄鱼最大发射波长在328 nm 处,表明不同冷藏时间大黄鱼的色氨酸发射光谱存在差异。

在发射光谱中最大荧光强度记为Imax,是荧光光谱的一个重要参数,对色氨酸残基所处环境的极性和荧光基团的运动很敏感[22-23]。由图1-B 可知,随冷藏时间延长,大黄鱼肉色氨酸最大荧光强度先降低后升高,第5 天时样品出现最低荧光强度(Imax=0.160 58),第8 天时样品出现最高荧光强度(Imax=0.162 63)。通常,冷藏过程中蛋白质变性导致色氨酸残基所处微环境改变,造成大黄鱼色氨酸最大荧光强度降低的主要原因是随着冷藏时间延长蛋白质发生变性,色氨酸侧链基团逐渐暴露于表面,所处的微环境极性增强,色氨酸荧光量子产率降低,从而导致荧光强度下降[24-26]。当大黄鱼冷藏8 d 后,Imax反而上升,这可能是暴露的疏水基团间相互作用,导致蛋白质聚集,色氨酸残基又重新被包埋于非极性环境所致[27]。

NADH 归一化荧光光谱如图2 所示,新鲜和不同冷藏时间大黄鱼NADH 发射光谱均在375、451、465 和559 nm 处出现荧光峰。另外,514 ～541 nm 波段内,冷藏8 d 样品的NADH 荧光强度高于新鲜样品的荧光强度。Perlin 等[28]用荧光法测得NADH 激发波长为340 nm 时,发射波长在451 nm 附近;465 nm 处的荧光峰是醛和氨基酸反应生成的荧光氧化产物所产生[29]。

虽然不同冷藏时间大黄鱼的荧光强度有所差异,但其光谱曲线趋势基本相同,很难通过光谱图区分不同冷藏期的大黄鱼。而化学计量学可最大限度地获取相关数据信息[30],因此,采用前表面荧光光谱法结合化学计量学方法对不同冷藏时间大黄鱼的光谱数据进一步分析。

图1 大黄鱼肉样色氨酸归一化荧光发射光谱Fig.1 Normalized fluorescence emission spectra of tryptophan in Pseudosciaena crocea muscle samples

2.2 基于荧光光谱的主成分分析

图2 大黄鱼鱼肉样品NADH 归一化荧光发射光谱Fig.2 Normalized fluorescence emission spectra of NADH in Pseudosciaena crocea muscle samples

PCA 是将多个指标转化为少数几个综合指标的一种统计分析方法,对归一化后的光谱数据进行主成分分析,使综合指标尽可能地代表原指标的信息,且彼此间互不相关,以解决谱带重叠的问题[31-33]。通常,第一主成分图像包含样品绝大部分信息,第二主成分图像包含的样品信息少于第一主成分,累计贡献率达到85%以上为宜[34]。由表1 可知,色氨酸荧光光谱前两个主成分累积贡献率达到85%,包含了原始光谱的主要信息,以前两个主成分得分绘制散点图(图3-A)。NADH 荧光光谱前三个主成分累积贡献率达到85%,为减少信息损失,以前三个主成分得分建立散点图(3-B)。由图3 可知,对不同冷藏时间处理的大黄鱼样品数据进行降维处理后,色氨酸、NADH 荧光光谱均可区分不同冷藏时间的大黄鱼,且前者的区分效果更好。但是不同冷藏时间的平行样品较分散,需采用判别分析方法进一步对样品分类。

表1 大黄鱼鱼肉样品中色氨酸、NADH 荧光光谱主成分分析结果Table 1 Results obtained in principal component analysis(PCA)of tryptophan and NADH fluorescence emission spectra in Pseudosciaena crocea muscle samples

图3 大黄鱼鱼肉样品中色氨酸(A)、NADH(B)荧光光谱主成分分析得分图Fig.3 Principal component analysis similarity map of tryptophan(A)and NADH(B)fluorescence emission spectra in Pseudosciaena crocea muscle samples

2.3 Fisher 函数的建立和验证

2.3.1 基于荧光光谱的Fisher 线性判别分析 FLDA的目的是使各个组间的重心距离最大且组内差异最小,在充分保存现有信息的前提下,使同类数据间的差异性尽可能缩小,不同类数据间的差异尽可能扩大[35]。由表2 可知,色氨酸荧光光谱数据获得3 个典则判别函数,其特征值为21.206、5.587、2.957,分别能解释方差的71.3%、18.8%、9.9%;NADH 荧光光谱数据获得3 个典则判别函数,其特征值为50.905、27.589、1.929,分别能解释方差的63.3%、34.3%、2.4%。由两组光谱数据的判别结果可知,函数1 和函数2 的Wilk’s Lambda 值较小,且典型相关性较强(P＜0.001),因此函数1 与函数2 对模型判别效果极显著。

色氨酸荧光光谱判别函数1 和函数2 方差累积贡献率为90.1%;NADH 荧光光谱判别函数1 和函数2方差累积贡献率为97.6%,均大于85%。根据典则判别函数得分绘制二维散点图可知,色氨酸和NADH 判别函数得分图类内聚情况较为集中(图4),因此FLDA的区分效果优于PCA。

2.3.2 Fisher 线性判别函数分析结果 判别函数的区分能力通过Leave-one-out 进行交叉验证。交叉验证是一种重要的判别效果验证方法,Leave-one-out 的优点是每一个样本都可作为校正集和预测集。由表3可知,色氨酸和NADH 荧光光谱总的判别正确率分别为100%和98%,说明判别模型可靠。

图4 大黄鱼鱼肉样品中色氨酸(A)、NADH(B)判别函数得分图Fig.4 Scatter plot of canonical discriminant functions of tryptophan(A)and NADH(B)fluorescence emission spectra in Pseudosciaena crocea muscle samples

表3 交叉验证集判别分析结果Table 3 Results obtained in the discriminant analysis of the cross validation

2.4 荧光光谱数据与贮藏时间的PLSR 模型的建立

对大黄鱼鱼肉样本的荧光光谱数据和冷藏时间建立PLSR 模型,考察前表面荧光光谱区分不同冷藏时间大黄鱼的可行性。评价模型质量的主要指标有校正集相关系数(correlation coefficient of calibration,Rc)、预测集相关系数(correlation coefficient of prediction,Rp)、校正均方根误差(root mean square error of calibration,RMSEC)、预测均方根误差(root mean square error of prediction,RMSEP)和交互验证均方根误差(root mean square error of cross validation,RMSECV)等。通常相关系数越接近1,RMSEC 和RMSEP 越小且越接近,或者RMSECV 越小,模型的预测能力越好[36]。由表4 可知,色氨酸和NADH 光谱的校正集和预测集的相关系数均大于0.9,且RMSEC 和RMSEP 均小于1;色氨酸和NADH 荧光光谱的RMSECV 分别为1.13 和0.41,说明模型的预测能力较好。由图5 可知,样本均分布于回归线周围,且距回归线较近,说明建立的模型较好。因此,前表面荧光光谱法结合PLSR 可用于预测冷藏大黄鱼的货架期。

3 讨论

近几年,多种光谱技术已应用于水产品鲜度的鉴别,但在实际研究中,红外光谱对环境要求较严格,而拉曼光谱信号受荧光干扰使得测量精确度和重复性不佳,高光光谱数据冗余严重、成本昂贵[14,37-39]。荧光光谱与其他光谱技术相比,灵敏度高、检测费用低、检测速度快。但要实现光谱技术由实验室分析阶段向在线分析方向的发展,就必须以大量基础研究及前期应用作支撑,因此,建立快速、无损、准确的测定大黄鱼冷藏时间的方法,对实现大黄鱼冷藏时间的评定具有重要的现实意义。

表4 光谱数据与冷藏时间的PLSR 模型Table 4 PLSR model of correlating between spectral measurement and refrigerated time

图5 大黄鱼鱼肉冷藏时间的预测值与实测值Fig.5 Reference vs predicted storage time for Pseudosciaena crocea muscle

王守业等[40]研究发现色氨酸残基在290 nm 处被激发后,于325 ～350 nm 范围内出现最大荧光强度;Dufour 等[41]利用前表面荧光光谱法鉴定鳕鱼、鲭鱼和三文鱼鲜度时发现,色氨酸发射光谱的最大荧光强度在336 nm 处,这与本研究结果相一致。本研究发现,新鲜与冷藏大黄鱼的色氨酸发射光谱存在差异,冷藏样品和新鲜样品相比荧光光谱发生轻微蓝移,这可能与色氨酸残基结构或所处的微环境发生改变有关[18]。Hassoun 等[17]利用前表面荧光检测鳕鱼的色氨酸光谱时发现,冷藏期鳕鱼的荧光光谱发生红移,与本研究结果不一致,可能是试验材料不同所致,本研究选用的是多脂的大黄鱼而鳕鱼属于低脂鱼类。

此外,大黄鱼肉在冷藏期间色氨酸最大荧光强度先降低后升高,冷藏5 d 时样品出现最低荧光强度(0.160 58),冷藏8 d 时样品出现最高荧光强度(0.162 63)。Hassoun 等[17]利用前表面荧光光谱法研究冷藏条件下鳕鱼的色氨酸光谱时发现,新鲜样品出现最高荧光强度,而冷藏8 d 时样品出现最低荧光强度,本研究在冷藏前期荧光强度也呈下降趋势。本研究发现在514～541 nm 波段内,冷藏8 d 样品的NADH荧光强度高于新鲜样品,但Dufour 等[41]利用前表面荧光光谱法研究鲭鱼的NADH 荧光光谱时发现,在此波段范围冷藏8 d 样品的荧光强度低于冷藏1 d 的样品;Olsen 等[42]利用前表面荧光光谱法结合动态顶空/气相色谱-质谱法研究鲑鱼鲜度时发现,荧光强度与脂肪氧化程度呈正相关。这可能是由于大黄鱼属于多脂鱼,在冷藏过程中,鱼肉脂肪氧化产物与氨基酸、肽、蛋白质、磷脂、核酸、脱氧核糖等相互作用,产生荧光性物质,导致样品的荧光强度升高[43]。

本研究结果表明,色氨酸、NADH 荧光光谱均可以实现对不同冷藏时间大黄鱼的区分,且前者的区分效果更好,但高亚文等[44]发现NADH 荧光光谱对样品的区分效果更好,这是因为NADH 的荧光强度与其含量有关,其含量高低又取决于β-羟基酰辅酶A 去氢酶(β-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase,HADH)的活性。有研究表明,利用HADH 酶活性区分新鲜、冷藏和冻融样品时发现,冻融样品的酶活性最大,新鲜与冷藏样品中HADH 酶活性差异不明显[45-47],因此NADH 荧光光谱更适用于区分新鲜与冻融样品。特征光谱结合FLDA 对不同冷藏时间大黄鱼的区分效果优于主成分分析。毕夏坤等[48]利用便携式近红外光谱仪判别鸡蛋的贮藏时间时发现,特征光谱结合FLDA 的区分效果优于PCA,这是因为FLDA 考虑了类间的差异,并将其最大化,所以区分效果较好。

近年来光谱分析技术已被应用于水产品的冷藏时间预测,如Nilsen 等[49]建立了可见近红外预测鳕鱼和鲑鱼冷藏时间的PLSR 模型,RMSECV 分别为1.04 和1.20;Sivertsen 等[50]建立了高光谱预测鳕鱼冷藏时间的PLSR 模型,RMSECV 为1.88。本研究建立的冷藏时间预测模型中,色氨酸和NADH 的RMSECV 分别约为1.13、0.41,且RMSEC/RMSEP 分别约为0.53、0.99,RMSECV 较小,RMSEC/RMSEP 均小于1 且接近,说明前表面荧光光谱法结合PLSR 模型可用于预测鱼肉的冷藏时间,且NADH 的预测效果相对较好。但仍需通过扩大样本量来进一步验证模型的稳定性以提高模型整体的可靠性及预测精度。

4 结论

色氨酸和NADH 是细胞内两种重要的内源荧光物质,前表面荧光光谱法作为一种无损检测技术能够快速地从大黄鱼中提取色氨酸和NADH 光谱信息,可为水产品品质评价提供依据。利用PCA 和FLDA 均可区分新鲜和不同冷藏时间的大黄鱼,但是后者的区分效果优于前者。根据不同冷藏时间鱼肉的色氨酸和NADH 荧光光谱,用校正集样本的光谱数据与冷藏时间建立PLSR 模型,对样本的冷藏时间有较好的预测;在定性区分上(PCA、FLDA),以色氨酸为荧光探针效果较好,在冷藏时间的定量预测上,以NADH 为荧光探针预测效果更好。前表面荧光光谱法结合化学计量学技术可用于鉴定水产品冷藏时间。本研究结果为前表面荧光光谱在水产品鲜度评价中的应用提供了科学依据。