杨晓梦 杜 娟 李 霞 普晓英 曾亚文杨加珍 Muhammad Kazim Ali 杨 涛

(1云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所/云南省农业生物技术重点实验室,云南昆明 650205;2 联邦乌尔都艺术科技大学生物技术系,卡拉奇 75300,巴基斯坦)

有色大麦(Hordeum vulgareL.)是由不同色素积累在种子果皮和糊粉层内而形成,其所含的花色苷、氨基酸、酚类化合物、微量矿质元素等活性物质普遍高于普通大麦,是珍贵的药食兼用作物[1]。有色大麦具有抗氧化[2-3]、抗衰老[4]、预防心血管疾病[5]、抗炎[6]、抗肿瘤[7]及降血糖[8-9]等功能,其中起作用的关键成分是花色苷。有色大麦在促进人类健康和营养功能性食品开发方面具有巨大潜力[10],因此剖析大麦籽粒花色苷含量的遗传变异特点,对培育高花色苷含量大麦具有重要意义。

目前,有色大麦主要有黄、紫、黑和蓝4 种颜色,不同颜色大麦的花色苷组成成分及含量存在差异[1,11-12]。研究表明,黄色大麦不含花色苷,而黑色和蓝色大麦含有矢车菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin-3-glucoside,C3G)和飞燕草花色素- 3-葡萄糖苷(delphinidin-3-glucoside,Dp),紫色大麦含C3G、Dp和天竺葵花色素- 3 -葡萄糖苷(pelargonidin-3-glucoside,P3G)[11]。Kim 等[12]研究表明,不同颜色大麦(共127 种基因型)花色苷含量变异范围为13.0 ～1 037.8 μg·g-1。其中蓝色和紫色大麦的花色苷含量显著(P＜0.05)高于黑色,紫色大麦中C3G 含量最高,蓝色和黑色大麦Dp 含量最高。Bellido 等[3]检测到黄色大麦和紫色大麦的总花色苷含量分别为210 和573 μg·g-1,且花色苷主要集中在麸皮,黄色大麦和紫色大麦麸皮中花色苷含量分别高达1 587 和3 534 μg·g-1,其花色苷含量明显高于吴晓敏等[13]报道的内蒙产紫色马铃薯(13.68 mg·100g-1)、山东产紫色马铃薯(6.15 mg·100g-1)和Abdel-Aal 等[14]报道的红水稻(22 μg·g-1)、蓝小麦(153 μg·g-1)、紫小麦(13 μg·g-1)、紫玉米(965 μg·g-1)、粉玉米(93 μg·g-1)、红玉米(559 μg·g-1)和蓝玉米(225 μg·g-1)。王楠等[15]研究发现,不同品种、不同颜色大麦籽粒中花色苷成分及其质量分数不同,其花色苷质量分数在0 ～182.41 μg·g-1之间。胡家坤等[16]分析表明,不同颜色的地方大麦籽粒花色苷和总黄酮的质量分数及其比值均存在明显差异。申晓蓉等[17]和张帅等[18]研究发现,不同粒色大麦(青稞)间的营养成分(淀粉、膳食纤维、蛋白质等)和抗氧活性物质(总酚、黄酮、维生素)差异显著。但前人对大麦花色苷的研究,主要集中在花色苷组成成分及不同大麦品种花色苷含量变异方面,而对紫色大麦/黄色大麦构建的重组自交系群体花色苷含量的遗传变异的研究鲜见报道。本研究以云南特有的紫光芒裸二棱(成熟时全株紫色)(母本)×Schooner(成熟时全株黄色)(父本)为亲本构建的193 个重组自交系为研究材料,分析大麦籽粒总花色苷含量的遗传变异及其与粒色的相关性,以期为高花色苷大麦种质创新及选育提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以紫光芒裸二棱(成熟时全株紫色)(母本)×Schooner(成熟时全株黄色)(父本)为亲本,其中,紫光芒裸二棱(Ziguangmangluoerleng,简写为Zgmlel)属云南地方特有的有色大麦品种,源于云南省昭通市;Schooner 属普通大麦品种,源于澳大利亚。

1.2 试验方法

1.2.1 田间种植 2013 年秋季,在玉溪试验基地种植亲本及其193 个F9重组自交系(recombinant inbred line,RIL)株系;2014 年秋季,在白邑试验基地种植亲本及其193 个F10RIL;2015 年秋季,在嵩明试验基地种植亲本及其193 个F11RIL。试验地肥力均匀,行长2 m,行距为0.3 m,每行100 粒种子,1 行区,按顺序排列,设2 次生物学重复。其他同当地常规栽培管理,分别于次年4 月中下旬待籽粒完全成熟后按株系收获。白邑和嵩明属于高海拔冷凉地区(海拔分别为1 973 m 和1 918 m;年平均气温分别为13.0、14.1℃),玉溪属于低海拔高温地区(海拔1 638 m,年平均气温24.2℃),3 个试点种植当年全年气候均正常。

1.2.2 大麦籽粒总花色苷含量的测定 参照覃鸿妮等[19]和Hosseinian 等[20]的pH 示差法测定大麦籽粒总花色苷含量。

1.2.3 大麦籽粒颜色划分 参照大麦测试指南(NY/T 2224-2012)[21]。采用目测法观察大麦籽粒颜色,将粒色划分为1～5 个等级,分别为1(黄色)、2(灰褐)、3(浅紫)、4(紫)、5(紫黑)(图1),3 年收获的大麦籽粒颜色基本一致。

1.3 数据统计

采用SPSS 20.0 软件进行数据统计及相关性分析。

图1 大麦RIL 群体籽粒颜色划分Fig.1 Grain color grade in barley grain of RIL population

2 结果与分析

2.1 大麦籽粒总花色苷含量的表型变异分析

由表1 可知,玉溪、白邑和嵩明试验点亲本紫光芒裸二棱和Schooner 之间总花色苷含量差异均达到极显著水平(P＜0.01)。3 个试验点大麦总花色苷含量在供试的RIL 群体中呈现广泛遗传变异。玉溪大麦籽粒总花色苷含量变异范围为0.36 ～1.38 mg·g-1,其最高含量(1.38 mg·g-1)是最低含量(0.36 mg·g-1)的3.8 倍;白邑大麦籽粒总花色苷含量变异幅度为0.50～1.50 mg·g-1,最高含量(1.50 mg·g-1)是最低含量(0.50 mg·g-1)的3 倍;嵩明大麦籽粒总花色苷含量变幅为0.50～1.58 mg·g-1,其最高含量(1.58 mg·g-1)是最低含量(0.50 mg·g-1)的3.2 倍。玉溪、白邑、嵩明大麦籽粒总花色苷含量变异系数分别为33.85%、26.58%和25.00%。玉溪大麦籽粒总花色苷含量变异系数(33.85%)最大,这与标准差反映的离散程度相一致。RIL 群体总花色苷平均含量表现为玉溪(0.65 mg·g-1)＜白邑(0.79 mg·g-1)＜嵩明(0.84 mg·g-1),差异极显著(P＜0.01),表明环境对大麦籽粒总花色苷含量有一定影响。此外,大麦籽粒总花色苷含量的偏度和峰度均为正值,且绝对值总体大于1,呈右偏态,尖顶峰分布特征,由主效基因控制遗传。

表1 大麦籽粒总花色苷含量Table 1 Total anthocyanin content in barley grains

由图1 可知,大麦总花色苷含量存在一定双向超亲分离现象。玉溪试验点RIL 群体总花色苷含量在0.45～0.50 mg·g-1分布最多,有22 株高于高亲紫光芒裸二棱,35 株低于低亲Schooner。白邑试验点RIL 群体总花色苷含量在0.65～0.70 mg·g-1分布最多,有32株高于高亲紫光芒裸二棱,28 株低于低亲Schooner。嵩明试验点RIL 群体总花色苷含量在0.80 ～0.85 mg·g-1分布最多,有24 株高于高亲紫光芒裸二棱,47株低于低亲Schooner。说明该RIL 群体可筛选出花色苷超亲株系。

图2 大麦籽粒总花色苷含量频率分布Fig.2 Frequency distribution of total anthocyain content in barley grains

2.2 高花色苷含量大麦株系筛选

由表2 可知,F值(15.28)＞1,差异极显著(P＜0.01),说明大麦193 个重组自交系籽粒总花色苷含量之间的差别有统计学意义。高亲紫光芒裸二棱总花色苷含量均值为1.04 mg·g-1,3 个试验点的超亲株系中,有16 个株系编号一致,其中有8 个株系的总花色苷含量显著或极显著提高,编号分别为27、34、35、37、38、60、138、167,总花色苷含量均值分别为1.26、1.25、1.21、1.42、1.26、1.17、1.29、1.18 mg·g-1(图3)。这8 个株系除27 号为紫黑色大麦,其余株系均为紫色大麦(表3)。

表2 紫光芒裸二棱×Schooner 大麦RIL 群体籽粒总花色苷含量方差分析Table 2 Variance analysis of total anthocyanin content in barley grains of RIL population derived from Zgmlel×Schooner

图3 大麦RIL 群体超亲株系籽粒总花色苷含量散点分布Fig.3 Scatter plot of total anthocyanin content in barley grains of over-parent RIL lines

表3 超亲株系与紫光芒裸二棱总花色苷含量差异显著性比较Table 3 Comparison and analysis of the difference of total anthocyanin content between over-parent lines and Zgmlel

2.3 大麦籽粒总花色苷含量和粒色相关分析

由表4 可知,3 个试验点间大麦籽粒总花色苷含量间均呈极显著正相关,表明大麦总花色苷含量主要受基因型控制。3 个试验点大麦总花色苷含量与粒色均呈极显著正相关,说明在一定程度上,大麦籽粒颜色越深,其总花色苷含量越高。

3 讨论

前人关于花色苷含量的变异分析多集中于水稻、玉米、小麦等作物,如孙明茂等[22]分析表明,F5家系糙米总花色苷含量变异幅度为0 ～5 459.34 mg·kg-1,平均值和变异系数分别为 834.47 mg·kg-1和191.96%,呈右偏态、尖顶峰分布。黄莹莹[23]研究发现,F3家系水稻籽粒总花色苷含量变幅为0.15 ～5.97 μg·g-1,平均值和变异系数分别为1.80 μg·g-1和67.72%,呈近正态分布。张名位等[24-25]研究发现,不同黑米品种花色苷含量变幅(0.65 ～14.98 μg·g-1)和变异系数(57%)较大,呈偏态单峰分布,黑米F2群体呈近似正态分布。Kim 等[26]报道,黑稻×白稻的F2、F3群体花色苷含量呈偏态分布,黑稻×黑稻的F2群体呈正态分布。柏鹤等[27]分析发现,黑巨胚糯米1464 和黑米1432 品种的花色苷含量最高,较其余18 个品种高253.23% 和248.83%。本研究结果表明,玉溪(2013 年)、白邑(2014 年)及嵩明(2015 年)3 个试验点大麦总花色苷含量变幅分别为0.36 ～1.38、0.50 ～1.50、0.50～1.58 mg·g-1,平均值分别为0.65、0.79 和0.84 mg·g-1,变异系数分别为33.85%、26.58%和25.00%。大麦总花色苷含量变异幅度大于前人[12,15-16]的报道,表明紫光芒裸二棱×Schooner 构建的大麦RIL 群体总花色苷含量呈广泛遗传变异,适合用于基因定位研究及高花色苷含量材料筛选。3 个试验点大麦RIL 群体总花色苷含量的偏度(1.22、1.33、1.14)和峰度(0.75、1.09、0.81)绝对值总体上大于1且均为正值,呈右偏态、尖顶峰分布特征,表明大麦籽粒总花色苷含量主要受主效基因控制遗传,这与前人研究结果[19,22,24,28-29]基本一致。

表4 大麦籽粒总花色苷含量与粒色的相关性分析Table 4 Correlation coefficient between total anthocyanin content and grain color in barley grains

我国有色大麦改良品种对象主要是黑大麦,已报道的有甘垦5 号[30]、垦啤黑糯1 号[31]、赣大麦1号[32]、荆黑大麦1 号[33]等。王楠等[15]、胡家坤等[16]以25 个不同颜色的地方大麦品种为材料,筛选出高花色苷紫黑色大麦品种宜平长方头,总花色苷含量为291.16 μg·g-1。本研究中,3 个试验点的超亲株系中有16 个株系编号一致,其中有8 个株系(27、34、35、37、38、60、138、167)的总花色苷含量显著或极显著提高,且均高于前人[3,12,15-16]的报道。除27 号为紫黑色大麦,其余株系均为紫色大麦。有研究认为紫大麦及紫黑色大麦可能含有促进花色苷合成与积累的某些代谢酶基因[16],这与本研究结果一致。因此可利用这些超亲株系配制高花色苷近等基因系,为后续基因精细定位及克隆奠定基础。此外,这些高花色苷家系可进一步培育开发为高花色苷大麦新品种,满足市场需求。

李海芬等[34]发现花生花青素含量及相关基因表达量越高,其种皮颜色越深。覃鸿妮等[19]认为F2∶3群体玉米籽粒花色苷含量与黑色素含量呈极显著正相关。陈廷文[35]分析发现水稻颖壳颜色越深,糙米颜色越深,花色苷含量越高;Ham 等[36]发现C3G 含量与稻米籽粒颜色呈显著正相关。孙明茂等[22]分析表明,F5家系糙米总花色苷含量与粒色极显著正相关(0.69**)。紫苏酚类物质含量与粒色等多个农艺性状存在相关性[37-38]。本研究结果表明,3 试验点大麦RIL 群体总花色苷含量与粒色呈极显著正相关(0.745**、0.693**、0.795**),这与前人研究结果一致。表明在一定程度上,大麦籽粒颜色越深,其总花色苷含量就越高。这可能主要与大麦遗传因素有关,但具体原因有待进一步深入研究。因此,籽粒颜色可作为高花色苷含量大麦品种筛选的辅助选择指标。

此外,花色苷含量虽然主要由遗传因素控制,但环境也能影响花色苷含量[39]。如李迪秦等[40]研究发现温度是影响不同种植季节早、中、晚稻花色苷含量的主要因素。高温(早、中稻时期)导致花色苷含量降低;低温(晚稻时期)有利于花色苷含量提升。蔡光泽[41-43]研究表明低温促使黑米颜色加深,有利于黑米花色苷含量积累;光照强度减弱(遮光处理)对花色苷含量影响不大;不同施肥水平对红黑米着色度影响不大。杨晓梦等[44]研究表明海拔和温度均对大麦活性成分有一定影响。本研究中,大麦RIL 群体总花色苷平均含量表现为玉溪(0.65 mg·g-1)＜白邑(0.79 mg·g-1)＜嵩明(0.84 mg·g-1),差异极显著。研究表明,高温能促进籽粒灌浆,从而加快养分的消耗,导致花色苷累积不充分[41],这与本研究结果一致。推测其原因可能是,高海拔冷凉气候有利于大麦花色苷等活性成分累积,且嵩明气候条件较佳(白邑和嵩明属于高海拔冷凉地区,玉溪属于低海拔高温地区)。但大麦花色苷合成和积累过程复杂,该推论仍有待进一步深入研究及验证。

4 结论

本研究结果表明,不同环境下大麦籽粒总花色苷含量在RIL 群体中存在广泛的遗传变异,呈右偏态、尖顶峰分布,说明由主效基因控制遗传。不同环境下大麦籽粒总花色苷含量与粒色均呈极显著正相关,表明大麦总花色苷含量与籽粒颜色之间存在紧密的正向关系。高海拔冷凉气候在一定程度上有利于大麦籽粒总花色苷含量的累积,初步揭示了不同海拔气候对大麦籽粒花色苷含量的影响规律,并筛选了一批高花色苷含量的优异大麦新种质。本研究结果为高花色苷功能大麦种质创新、优异基因资源筛选及后续育种利用提供了一定的理论依据。由于环境因素和花色苷合成途径的复杂性,本研究对大麦籽粒总花色苷含量的具体提升与进化机理及其与粒色间的遗传关联仍有待进一步深入研究及验证。后续研究建议基于上述大麦RIL群体籽粒总花色苷含量的遗传变异及相关性状表型数据,可进行花色苷分子标记定位及相关基因挖掘研究。