杨双娟 王志勇 赵艳艳 魏小春 原玉香 张晓伟

(河南省农业科学院园艺研究所,河南 郑州 450002)

大白菜(Brassica rapaL.ssp.pekinensis)是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一,在我国蔬菜作物中占有重要地位[1-2]。在生产上,如果播种时期不适宜或者外界环境的刺激,都会造成大白菜先期抽薹,从而影响叶球的产量和品质,造成严重的经济损失[3-4]。因此,开发与抽薹相关的特异分子标记,对于培育耐抽薹的大白菜新品种具有重要意义。

FLOWERING LOCUS C(FLC)编码MADS-box 类转录因子,是拟南芥的开花抑制因子,其通过抑制FT(Flowering Locus T)和SOC1 基因的表达,阻止顶端分生组织从营养生长向生殖生长转换,从而抑制拟南芥的开花[5-7]。目前白菜类作物中已克隆了4 个FLC同源基因(BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3 和BrFLC5)[8],在拟南芥中过表达BrFLC1、BrFLC2 和BrFLC3 能够明显延迟抽薹开花[9]。同时,正向遗传学研究表明BrFLC1是控制抽薹开花的1 个主效QTL 位点[10-11]。Yuan等[3]研究发现BrFLC1 基因第6 个内含子的第1 个碱基(Pi6+1)G-A 的SNP 变异和大白菜抽薹开花性状显著相关,G-A 突变改变了pre-mRNA 的剪切方式,当Pi6+1 处碱基由G 突变成A 后,可变剪切产生不正常的转录本,导致终止密码子提前出现或缺失一段外显子,进而导致BrFLC1 蛋白功能缺失,正常的延迟开花功能丧失。原玉香等[12]针对此单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点开发了酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)标记G-MvaI。但CAPS 标记需要结合PCR 扩增、限制性内切酶酶切和凝胶电泳才能实现基因分型,且其步骤较多,耗时较长,不能实现高通量、大样本量的检测。竞争性等位基因特异性 PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP),基于引物末端碱基的特异性匹配对SNP 进行精准的双等位基因判断,具有准确性高、低成本、高通量等优点,是目前国际上主流的SNP 分型方法[13-15]。目前,KASP 基因分型技术已应用于动植物的遗传图谱构建[16]、基因定位[17-18]、关联分析[19-20]、种质资源多样性分析[21-22]、分子标记辅助育种[23]、种子纯度鉴定[24]等方面,而关于大白菜KASP 标记的开发及应用的研究尚鲜有报道。

本研究针对BrFLC1 基因Pi6+1 处G-A 的SNP 变异开发KASP 分子标记,并验证该标记的实用性和准确性,以期为大白菜晚抽薹育种的分子标记辅助选择提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试大白菜材料共57 份,均来自河南省农业科学院园艺研究所。其中Y177-12 和Y195-93 用于前期开发KASP 标记,Y177-12 来源于日本商品种健春,属于晚抽薹类型;Y195-93 来源于商品种热抗白45,属于早抽薹类型。其余55 份用于KASP 标记通用性的验证。

1.2 基因组DNA 提取

将57 份大白菜材料的种子放在培养皿中加水催芽,待下胚轴长至1.5 ～2 cm 时,取子叶于2.0 mL Eppendorf 离心管中,采用CTAB 法[25]提取大白菜基因组DNA,用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop One(Thermo Scientific 公司,美国)检测DNA 的质量和浓度。

1.3 BrFLC1 的KASP-SNP 分子标记开发

从NCBI 上下载BrFLC1 基因的 DNA 序列(GeneBank 登陆号:AY115678),该序列全长1 651 bp,第6 个内含子的第1 碱基(Pi6+1)G-A 的SNP 变异和大白菜抽薹性状显著相关[12],该SNP 位点位于BrFLC1 基因序列的第1 101 bp 处。针对此SNP 位点设计KASP 标记BrFLC1-KASP1,包括3 条引物:BrFLC1-KASP1-A1:5′-FAM-CCATGTTTTGGCTAGCCA GG-3′;BrFLC1-KASP1-A2:5′-HEX-CCATGTTTTGGCT AGCCAGA-3′;BrFLC1-KASP1-C:5′-ATCGGATCGAAA CTTAAACCGT-3′。BrFLC1-KASP1-A1 和BrFLC1-KASP1-A2 为2 条等位基因特异性正向引物,3′末端碱基为Pi6+1 处SNP 位点变异碱基(G 或A),5′端分别加上FAM 和HEX 荧光序列标签序列。BrFLC1-KASP1-C 为共同的反向引物。引物均由上海铂尚生物技术有限公司合成。

1.4 KASP 基因分型

KASP-PCR 反应在384 孔PCR 仪(Eppendorf Mastercycler pro,德国)上进行,反应体系4 μL:1 μL DNA(60 ng·μL-1),2 μL KASP Master mix(2×),0.07 μL 引物混合物(由浓度为100 μmol·L-1的BrFLC1-KASP1-A1、BrFLC1-KASP1-A2、BrFLC1-KASP1-C 与ddH2O 按12∶12∶30∶46 的体积比混合得到),ddH2O 补足至4 μL。

KASP-PCR 扩增程序:第一阶段94℃变性15 min;第二阶段94℃变性20 s,61℃退火60 s,共10 个循环(从第2 个循环开始,每个循环降低0.6℃,);第三个阶段94℃变性20 s,55℃退火60 s,共26 个循环;第四阶段37℃降温保持1 min。

KASP-PCR 扩增产物用LC480II 荧光定量PCR 仪(罗氏,瑞士)进行终点法荧光信号读取。利用LC480 software v1.5.1 分析SNP 分型结果:聚合在X 轴附近的显示蓝色的基因型为连接FAM 荧光标签序列的等位基因型,聚合在Y 轴附近的显示绿色的基因型为连接HEX 荧光标签序列的等位基因型,中间显示红色的基因型为两种等位基因的杂合型,左下角显示黑色的样本为空白对照。

1.5 CAPS 法和直接测序法对BrFLC1-KASP1 鉴定结果的验证

参照原玉香等[12]的方法,利用CAPS 标记G-MvaI对57 份大白菜材料进行基因型鉴定:使用引物FLC1F4 和FLC1R1 进行PCR 扩增,之后用限制性内切酶MvaI进行酶切。酶切体系15 μL:5 μL PCR 扩增产物,1 μL 10×Buffer R,0.5 μL 限制性内切酶MvaI(10 U·μL-1),8.5 μL ddH2O。37℃保温2.0 h 完全酶切,用1%琼脂糖凝胶电泳检测。基因型为G 时,MvaI能够将PCR 产物剪切成448 bp 和491 bp 的两个片段;基因型为A 时,PCR 产物不能被MvaI酶切,片段长度为940 bp。

直接测序法:使用引物FLC1F4 和FLC1R1 进行PCR 扩增,之后将PCR 扩增产物送至铂尚生物技术(上海)有限公司使用引物FLC1R1 进行单向测序,获得的测序峰图文件用SeqMan(Version 7.1)软件进行多序列比对,确定各样品的基因型。

2 结果与分析

2.1 BrFLC1-KASP1 分子标记的开发

针对BrFLC1 基因Pi6+1 处G-A 的SNP 变异设计KASP 标记BrFLC1-KASP1。原玉香等[12]通过测序分析得知Y177-12 和Y195-93 在Pi6+1 处的碱基分别为G 和A。利用标记BrFLC1-KASP1 对Y177-12 和Y195-93 进行基因型鉴定,结果显示,Y177-12 的信号点为蓝色,5′末端连接FAM 荧光标签序列的引物竞争性扩增,聚合在X 轴附近,表明其基因型为G∶G;Y195-93 的信号点为绿色,5′末端连接HEX 荧光标签序列的引物竞争性扩增,聚合在Y 轴附近,表明其基因型为A∶A(图1-A)。综上,BrFLC1-KASP1 对Y177-12 和Y195-93 基因型鉴定结果与原玉香等[12]测序结果一致,BrFLC1-KASP1 标记开发成功。

将Y177-12 和Y195-93 的基因组DNA 分别稀释成10、20、60、80、100、150、200 和400 ng·μL-1,利用BrFLC1-KASP1 标记进行KASP 基因分型。结果显示,10～400 ng DNA 模板量均能产生较好的KASP 基因分型(图1-B),表明BrFLC1-KASP1 标记对模板DNA 的浓度敏感度较小,模板量许可范围较大。

图1 BrFLC1-KAPS1 分子标记的开发Fig.1 The development of marker BrFLC1-KAPS1

2.2 BrFLC1-KAPS1 分子标记的通用性

为了验证BrFLC1-KASP1 标记在其他大白菜材料中的适用性和通用性,利用该标记对57 份大白菜材料进行基因分型。结果显示,标记BrFLC1-KASP可将57份材料划分为3 组,其中21 份材料的信号点为蓝色,基因型为G∶G;34 份材料的信号点为绿色,基因型为A∶A;样品J3 为Y177-12 和Y195-93 杂交而得的F1,样品P3 为SY2004 和YR16-11 的杂交种,这2 份材料的信号点为红色,为杂合基因型G∶A(图2-A、B 和表1),表明该标记不仅能够有效区分2 种纯合基因型,且能够鉴别出杂合基因型,具有共显性特点,在大白菜材料中具备通用性和实用性。此外,KASP 基因型读取时,可以按照图2-A 所示每个样品所显示的颜色来鉴定基因型,蓝色基因型为G∶G,绿色为A∶A,红色为杂合G∶A,基因型读取方便高效。

2.3 BrFLC1-KAPS1 分子标记的准确性

为验证BrFLC1-KASP1 标记对57 份大白菜材料基因分型的准确性,利用CAPS 标记G-MvaI和直接测序法对57 份材料进行基因分型。CPAS 标记G-MvaI基因分型结果和KASP 标记BrFLC1-KASP1 的分型结果完全一致(表1 和图3)。其中21 份材料的电泳条带大小在500 bp 左右,为448 bp 和491 bp 2 个片段的混合物[3],基因型为G∶G;34 份材料的电泳条带为940 bp,基因型为A∶A;样品J3 和P3 同时具有上述2种条带,是杂合类型,基因型为G∶A。直接测序法是检测SNP 的金标准[26-27]。本试验对57 份大白菜材料进行直接测序,分析发现57 份材料的基因型与KASP 标记BrFLC1-KASP1 和CPAS 标记G-MvaI基因分型结果完全一致(表1)。由图4 可知,样品J3 和P3 在Pi6+1处测序峰图为A 和G 两种碱基,即基因型为杂合G∶A,与BrFLC1-KASP1 以及G-MvaI的检测结果一致。

3 讨论

KASP 基因分型技术能够实现高通量,且成本低、准确性高,是目前国际上主流的SNP 分型方法[13,28]。赵勇等[26]比较了直接测序法、CAPS 和KASP 标记技术3 种方法对大豆Dt1 基因4 个SNP 的分型结果,发现KASP 标记技术最省时,其次是直接测序法,CPAS标记技术最耗时,且KASP 标记技术法最经济。Rasheed 等[29]研究认为,从时效性来看,KASP 标记技术比基于凝胶技术的分子标记技术快45 倍。Semagn等[13]研究认为,从经济性和准确性而言,KASP 标记技术都优于DNA 芯片技术。Ertiro 等[24]比较了KASP和高通量测序基因分型(genotyping by sequencing,GBS)法在玉米种子纯度鉴定方面的应用,认为KASP标记技术更经济有效。FLC是芸薹属抽薹开花时间调控的关键基因,前人分别针对抽薹开花相关基因BrFLC1[12]、BrFLC2[30]、BrFLC5[31]开发了基于凝胶电泳和限制性内切酶酶切技术的CAPS、InDel 和dCAPS分子标记,以便用于分子标记辅助育种。

表1 不同基因型分型方法对57 份大白菜材料基因型鉴定结果Table 1 The genotypes of 57 accessions identified by different genotyping methods in Chinese cabbage

本研究针对BrFLC1 基因Pi6+1 处G-A 的SNP 变异成功开发了KASP 分子标记BrFLC1-KASP1,这是大白菜开花相关基因第1 个高通量分子标记。该标记的基因型鉴定结果与CAPS 标记G-MvaI和直接测序法的鉴定结果完全一致,证明了BrFLC1-KASP1 标记的准确性和可靠性。而在时效性上,BrFLCl-KASP1 标记通过1 次PCR 即能借助软件清楚地辨别每个样品的基因型,效率远高于基于凝胶电泳和限制性内切酶酶切技术的分子标记。从经济成本来看,前人开发的抽薹开花相关基因的CAPS 和dCAPS 标记的成本绝大部分取决于限制性内切酶的成本,限制性内切酶的价格高则检测成本急剧增加,且凝胶电泳还会对环境造成污染,而本研究的BrFLC1-KASP1 标记整个检测过程只需要进行1 次PCR,成本低且对环境友好。此外,对不同DNA 模板量基因分型表明,BrFLC1-KASP1 标记对DNA 模板量许可范围较大,可以减少对DNA 质量的要求以及对DNA 浓度定量的必要性,使KASP 标记操作起来更加方便,扩大KASP 基因分型技术的应用范围。

图2 利用标记BrFLC1-KAPS1 对57 份大白菜材料进行KASP 基因分型Fig.2 KASP genotyping of 57 accessions by marker BrFLC1-KAPS1 in Chinese cabbage

图3 利用CAPS 标记G-MvaI 对57 份大白菜材料进行基因型鉴定Fig.3 The genotypes of 57 accessions identified by CAPS marker G-MvaI in Chinese cabbage

图4 直接测序法对部分材料的基因型鉴定Fig.4 Genotypes of part accessions identified by sequencing

4 结论

本研究首次开发了大白菜抽薹相关基因BrFLC1的KASP 标记BrFLC1-KASP1,其准确可靠性和通用性都得到了试验验证。该标记可以高通量检测BrFLC1的基因型,能够高效率、低成本应用于大白菜耐抽薹分子标记辅助育种,具有重要的应用价值。本研究结果能为大白菜其他功能基因的KASP 分子标记开发提供技术参考,具有重要意义。