戢敏，陈星，喻雪琴，陈芳，梅怡晗，梅小平

（1.川北医学院附属医院 感染科，四川 南充 637000；2.首都医科大学，北京 100069）

Epstein-Barr 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一种经呼吸道传染的DNA 疱疹病毒，在淋巴细胞内可长期潜伏存在，该病毒除可引起传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis, IM）外，也可引起急、慢性肝炎[1]，这可能与EBV 感染后肝细胞水肿、气球样变性或点状坏死、肝窦内以淋巴细胞、吞噬细胞浸润等关系密切。有学者研究表明，EBV 病毒感染后所致肝损伤及程度与EBV 单独感染、合并感染形式及免疫功能状态有着密切关系[2]。本文就56 例EBV 感染及感染状态所致相关性肝损伤患者进行回顾性分析，旨在了解单纯EBV 感染及合并其他病毒感染相关性肝损伤及程度与T 淋巴细胞亚群表达水平变化的相关性，为早期护肝、抗病毒治疗及免疫调节治疗提供一定的理论参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2012年6月—2018年8月川北医学院附属医院诊断为EBV 感染相关性肝损伤的56 例患者。其中，男性30 例，女性26 例；年龄10～60 岁，中位年龄35.7 岁。其中，单纯EBV 感染相关性肝损伤的患者36 例（单纯EBV 感染组）：男性20 例，女性16 例；年龄10～58 岁，中位年龄35.3 岁；合并其他病毒感染相关性肝损伤患者20 例（EBV 合并感染组）：男性12 例，女性8 例；年龄10～60 岁，中位年龄35.9 岁。诊断需符合下列2 条之一：①血清学抗体检测提示急性EBV 感染或慢性感染急性发作伴有肝损伤并达到肝炎诊断标准；②分子生物学方法包括PCR、原位杂交和Southern 杂交从患者血清检测EBV-DNA 阳性伴有肝损伤并达到肝炎诊断标准。同时选取同期20 例体检者为健康对照组。其中，男性11 例，女性9 例；年龄11～60 岁，中位年龄34.8 岁，3 组性别构成比、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 诊断标准

EBV 感染诊断需具备下列条件：①有典型临床表现和体征，如发热、咽峡炎、淋巴结肿大、肝脾肿大、皮疹等；②循环血常规异型淋巴细胞＞10%；③EBV衣壳抗原IgM（抗EBV-IgM）阳性；④肝功能损伤是指谷丙转氨酶升高4 倍以上，伴或不伴胆红素明显升高[3]，肝功能损伤由嗜肝或非嗜肝病毒感染所致，已排除药物、细菌、真菌、自身免疫因素等所致肝损伤。

1.3 治疗方法

所有EBV 相关性肝损伤患者入院后予卧床休息、调控体温及预防感染等对症治疗，由于是发病早期（病程的前1 或2 天），均使用阿昔洛韦静脉滴注治疗，疗程3～5 d。同时给与复方甘草酸苷针进行保肝治疗至肝功能正常，所有患者均在持续治疗第7天时采取静脉血做肝损伤指标与T 淋巴细胞亚群计数检测。患者在体温正常，肝功能正常后出院。

1.4 检测方法

1.4.1 标本采集 EBV 感染相关性肝损伤患者与健康对照组均于入院及体检当天采取循环静脉血分离血浆，并进行游离EBV-DNA 载量、肝功能、T 淋巴细胞亚群计数等检测；EBV 感染相关肝损伤患者采取循环静脉血进行甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、科萨奇B 组病毒及自免肝等检测，治疗7 d 后再进行游离EBVDNA 载量、肝功能、T 淋巴细胞亚群计数等检测。

1.4.2 循环血T 细胞亚群检测 取循环静脉血2 ml，乙二胺四乙酸二钾抗凝。在各试管中加入10 μl 由CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC 和CD3-FITC/ CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC 组成的四标记单克隆抗体，同时加注100 μl 抗凝循环静脉血混匀并标记30 min，并加入固定剂30 μl 固定5～10 min，随后加红细胞溶解液1 ml 溶解红细胞10～20 min，最后加磷酸盐缓冲液后用流式细胞仪计数10 000个淋巴细胞并进行分检。

1.4.3 循环血游离EBV-DNA 检测 EBV 感染相关性肝损伤患者EBV-DNA 检测采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR），试剂盒由中山大学达安基因公司提供，采用Icyclerq qRT-PCR 仪。

1.4.4 肝功能检测 采用ADVIA 2400 全自动生化分析仪检测肝功能，HBV 感染血清标志物（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）采用化学发光法检测，严格按说明书操作，其他病毒感染标志物采用酶联法检测。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验或方差分析，其中方差分析两两比较采用LSD-t检验；采用Pearson 进行相关性分析；P＜0.05 为差异有统计学 意义。

2 结果

2.1 EBV 感染分布及构成比

56 例EBV 病毒感染者中，单纯EBV 感染组36 例 （64.29%），EBV 合并感染组20 例（35.71%），其中合并HAV 感染2 例（3.57%），合并HBV 感染8 例（14.29%），合并HCV 感染1 例（1.79%），合并CBV感染2 例（3.57%），合并VZV 感染3 例（5.36%），合并HBV、VZV 感染4 例（7.14%）。

2.2 各组肝功能情况

各组肝功能指标比较，经方差分析，差异有统计 学意义（P＜0.05）；单纯EBV 感染组与EBV 合并感染组的肝功能指标均较健康对照组升高（P＜0.05），EBV 合并感染组肝损伤程度较单纯EBV 感染组重（P＜ 0.05）。见表1。

2.3 单纯EBV 感染组与EBV 合并感染组治疗前后T 淋巴细胞亚群的变化情况

治疗前各组T 淋巴细胞亚群水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；单纯EBV 感染组、EBV 合并感染组的CD3+T、CD8+T 水平高于健康对照组，CD4+T、CD4+/CD8+T 水平低于健康对照组（P＜ 0.05）；EBV 合并感染组CD3+T、CD8+T 高于单纯EBV 感染组，CD4+T、CD4+/CD8+T 水平低于单纯EBV 感染组 （P＜0.05）；治疗后单纯EBV 感染组CD3+T、CD8+T 水平较治疗前下降，CD4+T 水平较治疗前上升（P＜0.05）；治疗后EBV 合并感染组CD3+T、CD8+T 水平较治疗前下降，CD4+T、CD4+/CD8+T 水平较治疗前上升（P＜ 0.05），治疗后单纯EBV 感染组与EBV 合并感染组比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），EBV 合并 感染组CD3+T、CD4+T、CD8+T 水平高于EBV 单纯感染 组（P＜0.05）。见表2。

表1 各组肝功能指标比较 （±s）

表1 各组肝功能指标比较 （±s）

注：①与健康对照组比较，P ＜0.05；②与单纯EBV 感染组比较，P ＜0.05。

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表2 各组T 淋巴细胞亚群变化情况 （±s）

表2 各组T 淋巴细胞亚群变化情况 （±s）

注：①与健康对照组比较，P ＜0.05；②与治疗前比较，P ＜0.05；③与同列单纯EBV 感染组比较，P ＜0.05。

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2.4 单纯EBV 感染组治疗前后EBV-DNA 载量与T淋巴细胞亚群的相关性

单纯EBV 感染组治疗前后CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+T 水平 与EBV-DNA载量无相关性（P＞0.05）。见表3。

2.5 EBV 合并感染组治疗前后EBV-DNA 载量与T淋巴细胞亚群的相关性

EBV 合并感染组治疗前后CD3+T，CD4+T，CD8+T，CD4+/CD8+T 水平与EBV-DNA 载量间无相关性（P＞0.05）。见表4。

表3 单纯EBV 组治疗前后EBV-DNA 载量与 T淋巴细胞亚群的相关性

表4 EBV 合并感染组治疗前后EBV-DNA 载量与 T淋巴细胞亚群的相关性

3 讨论

病毒、药物、酒精等均可导致肝组织损伤，病毒感染是导致肝损伤最为常见的原因之一。除HBV、HCV 等嗜肝细胞病毒感染所致肝损伤外，目前的非嗜肝病毒如EBV 感染所致肝损伤的发生率也越来越高。EBV 是一种嗜淋巴细胞的DNA 病毒，属于疱疹病毒γ 亚科[4]，其通过侵犯B 淋巴细胞来发挥致病作用，因其表面存在EBV 受体而致B 细胞抗原性改变，活化T 淋巴细胞后转化为细胞毒性效应细胞（EBVCTL），从而直接破坏携带EBV 的靶细胞（主要为B淋巴细胞）。EBV感染可导致全身多系统，多器官损伤，其中肝脏是最常见的器官损害[5]。本组56 例EBV 合并感染中，合并HBV 感染最为多见，这与刘雅等研究报道一致[6]，该文献指出，各种合并型病毒性肝炎患者中HBV 重叠EBV 感染最为常见，这是由于HBV 感染者的人群基数大，同时慢性乙性肝炎患者体内T 淋巴细胞免疫调控功能低下，病程中易重叠感染EBV[7]。本研究结果表明，EBV 合并感染组肝损伤程度较单纯EBV 感染组重，这与蔡尚原等[8]报道相一致。可见EBV 合并其他病毒感染的患者肝功损害更重，且与单纯EBV 感染患者相比，合并EBV 感染可加重肝脏损害，更易进展为肝纤维化、肝硬化、肝癌[6]。EBV 感染所致肝损害的病理机制尚不完全清楚，EBV 本身不具备损害肝细胞、血管内皮细胞的作用，且损害程度与EBV 含量并无相关性，而肝细胞损伤的病理机制是因肝小叶、门管区单核淋巴细胞浸润（多为CD3+T、CD8+T 淋巴细胞），进而造成肝实质点状坏死伴胆汁淤积[9]。本研究结果表明，治疗前单纯EBV 感染组，EBV 合并感染组的CD3+T、CD8+T 细胞亚群水平高于健康对照组，CD4+T、CD4+/CD8+T 水平低于健康对照组，EBV 合并感染组CD3+T、CD8+T 高于EBV 单纯感染组，CD3+T、CD4+/CD8+T 水平低于EBV 单纯感染组，这与崔强华等[10]报道结果一致。作者认为，产生这一结果的原因可能是：CD3+是所有T 细胞的表面标志，CD4+是辅助性T 细胞（Th）的表面标志，具有辅助细胞免疫与体液免疫的作用，CD4+T 淋巴细胞的数量与频率上调，可诱发免疫功能亢进，CD4+T 淋巴细胞数量与频率的下调可表示免疫辅助功能降低，CD8+则是细胞毒性T 细胞（Tc）的表面标志，可直接杀伤靶细胞或诱导靶细胞凋亡，当CD8+T 淋巴细胞受到刺激后进行增殖，导致异性淋巴细胞比例增加[11]。EBV主要潜伏在B 淋巴细胞中，病毒增殖与高表达时细胞表面可表达多种抗原，并经抗原提呈细胞提呈后激CD8+T 淋巴细胞，引发细胞毒效应杀伤受到感染的B淋巴细胞，导致CD4+T 淋巴细胞大量消耗，外周血中CD4+T 细胞数量下降，患者出现CD4+/CD8+T 下降甚至倒置。CD4+及CD8+T 淋巴细胞比值反应机体的免疫状况，其数量与频率下调与免疫系统损伤的程度相关。本研究中合并感染组患者CD3+和CD8+T 淋巴细胞表达率高于单纯感染组，合并感染组患者CD4+T 淋巴细胞的表达率和CD4+/CD8+比值均低于单纯感染组，这提示合并感染组T 淋巴细胞亚群紊乱程度更高，与陈静[12]等研究结果相似。根据本实验的结果，作者推测，可能是合并感染组肝功能损害更为严重，患者T淋巴细胞激活程度更高，导致CD4+与CD8+T 淋巴细胞比例降低，产生大量促炎因子，使免疫损伤程度更重。本研究结果表明，治疗后CD3+T、CD8+T 较治疗前下调明显，CD4+T、EBV 合并感染组的CD4+/CD8+T上调，CD3+T、CD4+T、CD8+T水平高于EBV单纯感染组，作者分析认为，EBV 感染后的肝损伤常伴有Th1/Th2细胞比例失衡，表现为Th1 型细胞因子功能障碍，Th2型细胞因子功能加强，导致其免疫功能降低，促进病情进展。

本研究结果显示，两组治疗前后，CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+T 水平与EBV-DNA 载量无相关性，这与朱婵虹等[13]报道结果不一致，朱婵红等认为：EBV-DNA 水平主要是反应体内病毒复制及感染情况，EBV-DNA 水平与是否合并其他病毒感染以及病情的严重程度正相关，临床可以根据EBV-DNA 载量来判断病情严重程度[13]。笔者认为，EBV 病毒性肝炎的发生主要是T 淋巴亚群数量及频率紊乱导致免疫功能失衡，而CD3+、CD8+T 淋巴细胞浸润及所释放的致/抑炎因子失衡导致对肝细胞的免疫损伤，EBV 只是导致肝损伤中免疫反应发生的启动因子，与EBV-DNA 载量无关。张慧等[5]对EBV 感染后肝功能正常组和异常组患者的研究发现，两组患者外周血中EBV-DNA载量无差异，而肝功能异常组CD4+T 淋巴细胞、CD4+/CD8+T 下降更明显，表明EB 病毒性肝炎的发生与病毒载量无直接相关性。

笔者分析认为，对EBV 病毒感染所致病毒性肝炎，其肝损程度可能与机体是否合并其他病毒感染和机体免疫状况有关。EBV 肝炎也可能与EBV 病毒作为抗原能刺激机体产生特异性抗体，形成免疫复合物，激活免疫反应的强烈程度有关。本研究结果显示，多病毒重叠感染所致肝损伤明显，病情较重，病程长，这一点需引起重视[14]。本研究不足之处在于，由于是回顾性分析，未进行出院的随访与相关指标的跟踪，特别是T 淋巴细胞及主要细胞因子水平与EBV-DNA载量间关系的跟踪，有待进一步研究。加之，本研究样本偏少，研究对象仅为一个医疗机构而非多中心研究，数据存在偏差的局限性。但仍期望通过本研究加深临床医师对EBV 病毒感染的重视，患者在出现肝损伤时，不仅仅是嗜肝病毒感染可以，也要重视非嗜肝病毒感染及其他原因所致。