李 路 郭伟灵 周文斌 林怡辰 洪家丽 刘绘鹏 刘 斌* 倪 莉 饶平凡 吕旭聪，*

（1 福建农林大学 国家菌草工程技术研究中心 福州350002

2 福建农林大学食品科学学院 福州350002

3 福州大学 食品科学技术研究所 福州350108）

黄酒作为中华民族的国酒，是酿造史上最悠久的酒种[1-2]。红曲黄酒是以糯米为主要酿造原料，并以红曲和药白曲为发酵剂进行糖化发酵，是一种"多微共酵"酿制而成的低度黄酒[3-5]。红曲黄酒以色泽鲜红、味道醇厚、气味香浓而闻名，因添加红曲和药白曲而具有一定的生理功效。据了解，红曲是大米经过红曲霉等多种微生物发酵制成的一种酿造用曲，通常被应用于食品行业中的酒类酿造及食用色素生产等[6-8]。红曲霉产生的多种次级代谢产物具有抗炎、抗氧化、降血脂等功效[2，6，9]。药白曲是米粉（或米糠）中加入一些中草药和曲母共同发酵培养而成[10]。其中药白曲中的微生物以根霉为主[11]，能够产生高活力的糖化型淀粉酶，将大米中绝大部分的淀粉转化成可发酵糖。在黄酒酿造中加入药白曲可显著提高大米的糖化率和淀粉的利用率[12]。

酒曲作为“酒之骨”，是黄酒酿造的动力，其主要功能是给黄酒酿造提供酶和微生物。经各种酶分解的物质和微生物代谢的产物是构成黄酒风味的重要组成部分，使黄酒具有独特的风味[13-14]。本课题组前期开展了红曲黄酒传统酿造用曲（红曲和药白曲）中的香气组分及微生物多样性的研究，发现红曲和药白曲的挥发性组分具有显著的差异，猜测原因是传统制曲过程中的微生物菌群差异造成的。挥发性组分造就了黄酒的典型风味，在很大程度上决定了黄酒的感官质量[15]。然而，对于不同酿造用曲（红曲和药白曲）对红曲黄酒挥发性风味物质形成的影响，至今尚未见研究报道。探究酿造用曲对红曲黄酒挥发性物质组分的影响，对于深入解析红曲黄酒的香气特征，以及改良其品质具有重大意义。

顶空固相微萃取-气质谱联用（HS-SPMEGC/MS）技术已应用于各种类型酒样（如葡萄酒、红酒和白酒等）中挥发性香气成分的分析[16，17]。主成分分析（PCA）是一种利用原始数据呈现组间及组内差异的可视化技术，可从不同的维度反映不同样本之间的代谢组成差异[18-19]。正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）模型可过滤掉X轴中与Y轴不相关的变量信息，再结合VIP值使得分析组间的差异变量更加准确可靠[20]。本研究采用HS-SPME与GC-MS相结合的方法，检测不同酿造用曲（红曲和药白曲）酿制的黄酒中的挥发性风味组分，并借助PCA和OPLS-DA方法筛选出不同酿造用曲酿造的酒样中具有显著差异性的香气成分，了解酿造用曲对红曲黄酒香气成分形成的贡献。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乌衣红曲和南平药白曲，南平红曲黄酒酿造酒厂；2-辛醇（优级纯），美国Sigma公司；NaCl（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

50/30μm DVB/CAR/PDMS纤维头，美国SUPELCO公司；气相色谱-质谱联用仪7890A/5975MSD，美国Agilent公司；15mL顶空钳口样品瓶，上海安谱公司；DF-1型号集热式磁力搅拌器，金坛市鑫渃实验仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 红曲黄酒的酿造工艺 根据红曲黄酒的酿造方法分别在10 L的陶瓷坛中酿造，共设3个试验组，分别为A酒：红曲+药白曲；B酒：红曲；C酒：药白曲。具体工艺参数为：以蒸熟冷却后的糯米（4.0 kg）为原料，分别添加乌衣红曲（10%）、南平药白曲（1%）为发酵曲，糯米和酒曲落坛后加4.0 L冷开水，控制室温为20℃酿造60 d后终止发酵，分别从酒坛中取A、B、C 3种酒样进行挥发性风味组分分析。

1.3.2 HS-SPME方法 预处理：将萃取头置于气相色谱仪进样口（250℃，1 h）。

样品萃取：在样品瓶中加入NaCl 2.0 g，再加入6mL酒样和5μL内标（2-辛醇10mg/L），将瓶口用封盖器封好，放入磁力搅拌器预热（50℃，10 min），将萃取头插入样品瓶（未接触样品）萃取（50℃，30min）。

1.3.3 GC-MS设置 将萃取头从样品瓶中取出，快速插入气相色谱仪进样口（240℃，5min），开始GC-MS检测分析。气相色谱（GC）条件：载气为高纯度氦气（流速1mL/min）；进样口温度设置为起始40℃，5min，之后以5℃/min的速度升至120℃，然后以10℃/min的速度升至240℃，之后其运行温度为240℃，时间5min。质谱（MS）条件：接口280℃；连接杆150℃；EI电离源70 eV，离子源230℃，质量扫描范围m/z 35~450；ACQ方式Scan。

1.3.4 数据分析 将得到的总离子色谱图，在标准谱库（NIST11和Wiley）中比对并鉴定不同酒样中的挥发性物质，通过内标法的半定量分析得到各挥发性组分的质量浓度，之后将不同酒样的质量浓度数据导入SIMCA 14.1软件进行PCA和OPLS-DA，分析3种酒样的聚类规律，并筛选出不同酿造用曲酿造的酒样中具有显著差异性的挥发性物质，探究酿造用曲对红曲黄酒挥发性风味物质形成的影响。

2 结果与分析

2.1 不同黄酒酒样中的挥发性风味组分

不同酒样挥发性风味组分的SPME-GC/MS分析结果见图2。A酒与B酒的峰型和峰高极为相似，而C酒与A、B酒的峰型有明显的不同，且峰的数量也明显少于A酒与B酒。

图1 不同酒样中挥发性物质成分的总离子流色谱图Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in different liquor samples

图2 不同酒样中挥发性风味组分的热图分析Fig.2 Heatmap of volatile components in different liquor samples

通过数据库的比对，鉴定A酒、B酒和C酒3种酒样中的挥发性物质共80种，用R语言绘制成热图（图2）。图2中每种成分含量用不同的颜色表示，其中红色越深代表其含量越多，而蓝色越深则含量越少。图2香气组分热图分析显示，A酒有56种，B酒有58种，C酒有52种，其中，有33种是A酒、B酒和C酒3种酒样共有的香气成分，如：苯乙醇[F4]、乙酸乙酯[F17]、丁二酸二乙酯[F52]等；有50种是A酒和B酒共有的，有38种是A酒和C酒共有的，有36种B酒和C酒共有的。此外，80种香气成分中有5种是A酒特有的，如：辛酸辛酯[F41]、2-壬烯-1-丁醇[F42]、L-（+）-白氨酸[F43]、17-十八炔酸[F44]、1H-3α，7-雪松烷[F45]；有8种B酒特有的，如：3-羟基己酸乙酯[F59]、β-丁内酯[F58]、戊酸乙酯[F66]、2-甲基丁酸乙酯[F64]、3-乙基丁醇[F65]、棕榈酸[F61]、7-辛烯-2-醇[F62]、醋酸异冰片酯[F63]；有13种是C酒特有的，如：苯丙酰氯[F35]、香茅醇[F32]等。由此可知，A酒与B酒在香气成分组成及其含量上较相似，C酒与A酒和B酒的香气组成差异较大。

2.2 不同黄酒酒样挥发性风味组分的主成分分析

根据PCA数据分析显示，图3a为第1主成分与第2主成分双标图，可知A、B、C 3种酒样分别位于不同的象限中，说明这3种酒样的挥发性风味组分存在差异；而图3b为第1主成分与第3主成分双标图，A、B两种酒样集聚在Y轴的左边，与C酒样距离较远，说明A酒与B酒之间的挥发性组分差异较小，而与C酒存在较大的差异，初步推测红曲可能对红曲黄酒中挥发性风味物质形成的贡献较药白曲大。

2.3 不同黄酒酒样中的差异挥发性风味物质

OPLS-DA将X轴中与Y轴无关的信号过滤并去除，能够准确地区分两组之间的差异，提高模型的有效性[21]。在OPLS-DA模型中，两组样品之间的分类可以用得分散点图（Score Scatter Plot）和S型载荷图（S-plot）的形式进行可视化。OPLSDA得分散点图去除了噪音的干扰，展示关于数据集中的趋势和模式，其中R2X用于解释X方差检查模型调整的程度，当R2X和Q2接近1时，说明这个模型有较好的预测能力；当1＞R2X＞0.5和1＞Q2＞0.5时，建立的模型为良好[22-23]。本研究OPLSDA得分散点图（图4）显示分离清晰的样品，其相对应的R2X分别为71.3%（A与B），80.1%（A与C）和73.9%（B与C），而Q2分别为99%（A与B），100%（A与C）和100%（B与C），说明所构建的OPLS-DA模型对于差异挥发性风味组分的预测和筛选是有效的。

图3 基于PCA模型解析不同酒样挥发性风味组分Fig.3 Analysis of volatile flavor components of different liquor samples based on PCA Model

图4 基于OPLS-DA分析的分数散点图Fig.4 Score scatter plot based on OPLS-DA Analysis

如图5所示，在S型载荷图中轴线上的物质为两组酒样差异较小的物质，而远离原点为两种酒样的差异挥发性风味物质。由图5a分析得出A酒与B酒间的差异挥发性风味物质为苯乙醇[F4]、乳酸异戊酯[F13]、乙酸乙酯[F17]、乳酸乙酯[F26]、3-甲基-1-丁醇[F37]、辛酸[F51]、丁二酸二乙酯[F52]、β-丁内酯[F58]、辛酸乙酯[F60]和2-羟基-4-甲基戊酸乙酯[F68]，且这10种挥发性风味物质的VIP值均＞1，说明这些组分在A酒和B酒中的含量存在显著性差异。同上，由图5b、5c可知，A酒与C酒和B酒与C酒间的差异挥发性风味物质均为2-乙基-1-丁醇[F1]、苯乙醇[F4]、醋酸[F11]、乙酸乙酯[F17]、乙酸异戊酯[F24]、乳酸乙酯[F26]、苯丙酰氯[F35]和丁二酸二乙酯[F52]，这8种挥发性风味物质的VIP值均＞1，说明上述的挥发性物质含量具有显著的差异性。

3 讨论与结论

使用HS-SPME-GC/MS方法对3种酒样的香气成分进行鉴定，共鉴定到80种香气成分。香气组分热图分析显示，有33种是A酒、B酒和C酒3种酒共有的香气成分，有50种是A酒和B酒共有的，有38种是A酒和C酒共有的，有36种是B酒和C酒共有的。由此可知，A酒与B酒在香气成分组成及其含量上较相似，C酒与A、B酒的香气成分组成差异较大。

图5 基于OPLS-DA模型分析的S型载荷图Fig.5 S-plot load graph based on OPLS-DA model analysis

图6 基于OPLS-DA模型分析的VIP值柱形图Fig.6 Cylindrical graph of VIP values based on OPLS-DA model analysis

虽然热图分析能够简易、快速展示不同酒样中的挥发性香气成分组成及其含量，但并不能筛选出不同酒样之间的显著性差异挥发性风味物质。本研究采用PCA和OPLS-DA方法来筛选3种酒样具有显著性差异的挥发性风味物质，结果表明：A酒与B酒的显著性差异挥发性风味物质有10种，分别是丁二酸二乙酯（烤香、米香）、苯乙醇（甜香、玫瑰花香）、3-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯（花香、果香）、乳酸乙酯（花香、果香）、辛酸乙酯（水果香）、2-羟基-4-甲基戊酸乙酯、乳酸异戊酯、β-丁内酯和辛酸（汗臭）[24-25]。而A酒和B酒与C酒之间的显著性差异挥发性风味物质相同，共8种，分别为丁二酸二乙酯（烤香、米香）、乙酸乙酯（花香、果香）、乳酸乙酯（花香、果香）、苯乙醇（甜香、玫瑰花香）、醋酸（酸臭）、苯丙酰氯、乙酸异戊酯（香蕉味）和2-乙基-1-丁醇[24-25]。其中，A酒中的丁二酸二乙酯、苯乙醇、3-甲基-1-丁醇和乙酸乙酯含量明显高于B酒，这一现象可能是因红曲与药白曲共同酿造而得到的叠加效果。

由本研究的挥发性组分热图分析、主成分分析及正交偏最小二乘法判别分析模型可推断：红曲对红曲黄酒挥发性风味物质形成的影响较大，而药白曲对红曲黄酒挥发性物质形成的影响相对较弱。