王 永，王彩云，侯 俊，成忠均，周茂嫦，邹 涛，徐庆祝，阮培均*

(1. 毕节市中药研究所，贵州 毕节 551700; 2. 大方县扶贫开发办公室，贵州 毕节 551700)

蜜环菌(Armillariamellea)隶属担子菌门(Basidiomycota)、伞菌目(Agaricales)、泡头菌科(Physalacriaceae)、蜜环菌属(Armillaria)[1]，具有强筋壮骨、增智健脑、祛风活筋、降尿酸、延缓衰老以及明目的功效，其发酵产物对肢麻、抗菌、消炎、失眠以及耳鸣等症有较好的疗效[2-4]，主要分布于四川、吉林、山西、甘肃、湖北、辽宁、黑龙江、福建、贵州、云南等地，是天麻的共生菌，为天麻的生长发育提供养分。由于不同的天麻对蜜环菌菌株的适应能力存在差异，且不同蜜环菌菌株形成菌索的能力以及菌索侵染天麻皮层组织的能力也不同，因而生产上采用不同的蜜环菌菌株极有可能影响天麻的产量和质量。另外，由于我国蜜环菌的基础研究薄弱，对天麻共生蜜环菌的选育不够系统，导致天麻品种退化，产量不稳，病害逐年加重[5]。因此培育优良的蜜环菌菌株对提高天麻的产量和质量有重要意义。天麻(GastrodiaelataBlume)是一种药食同源的兰科多年生草本植物，富含多糖、酚类、甾醇和有机酸等多种化学成分，具有抗惊厥、降压、延缓衰老、抗炎、镇痛、保护神经细胞、增强免疫能力等功效[6-10]，也是临床常用的中药，根据茎秆颜色可分为黄天麻(GastrodiaelataBl. f. Flavida S. Chow)、绿天麻(GastrodiaelataBl. f. Viridis Makino)、红天麻(GastrodiaelataBl. f.elata)和乌天麻(GastrodiaelataBl. f. Glauca S. Chow)等变型[11]，其中红天麻的产量高于黄天麻、绿天麻和乌天麻。由于天麻具有独特的药用价值[12]，我国自20世纪70年代以来相继开展了天麻的相关研究，但主要集中于化学成分、种植生产、遗传多样性、指纹图谱、药理研究等方面[13-15]。农艺性状可以代表作物品质特征的相关性状，具有直接、便于观察以及与作物的生产直接关联等特点，也是药用植物品质评价的重要措施之一[16]。天麻地下块茎的产量、质量是由多个相关因素决定的，各农艺性状对产量、质量的影响有主次之分，且各个性状之间存在着不同程度的相关性[17]，在实际工作中，弄清各农艺性状对产量、质量影响的主次关系，可以为天麻栽培、品种选育和质量控制提供科学依据，但近几年有关蜜环菌对天麻产量、质量、农艺性状综合比较分析的研究报道较少[18-19]。本研究收集贵州主产区的野生蜜环菌资源，经分离纯化后筛选出5个优良蜜环菌菌株，并与红天麻进行仿野生栽培试验，研究各蜜环菌栽培种对青冈菌材的侵染情况以及对红天麻产量、农艺性状、有效成分含量的影响，以期筛选出适宜黔西北地区天麻生长的优良野生蜜环菌菌种。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试蜜环菌 2015年3月至11月采集贵州省天麻主产区的野生蜜环菌菌株，通过分离和纯化，并与陕西西乡食用菌研究所提供的A9菌株进行比较。筛选出5株优良的野生蜜环菌菌株，编号为MHJ-1、MHJ-3、MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8。各蜜环菌采样点详情见表1[20]。

表1 野生蜜环菌菌株采样点详情

1.1.2 供试材料 供试天麻由贵州省毕节市大方县九龙天麻开发有限公司提供，经贵州省毕节市中药研究所阮培均研究员鉴定为兰科天麻属植物红天麻(G.elataBl. f.elata)。选择无损伤、大小均匀、无病虫害的白麻作试验用种。

1.1.3 主要试剂 天麻素(批号：110807-201608)、对羟基苯甲醇(批号：111970-201702)对照品购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯(迪马科技有限公司)，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

1.1.4 仪器及色谱条件 Agilent 1260高效液相色谱仪；色谱柱：Zorbax SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：0.05%(质量分数) H3PO4∶乙腈=97∶3，流量：1 mL/min，检测波长220 nm，柱温35 ℃，天麻素峰保留时间5.17 min，对羟基苯甲醇峰保留时间8.75 min。

1.2 方法

1.2.1 蜜环菌栽培种培养 配方(质量分数，%)：锯木段50，木屑20，玉米面7，麸皮20，白糖2，石膏1，加水至含水量为70～80，装入菌袋，塞上棉塞，121 ℃灭菌45～60 min。培养条件：培养温度24～26 ℃，光照时间10～12 h/d，光照强度1 500～2 000 lx。

1.2.2 菌材培养 参照文献[21]的方法，在挖好的各小区(0.5 m2)内培养菌材。选择长40～50 cm、直径6.0～7.0 cm的青冈木段，于两侧每隔5.0～7.0 cm砍一个深至木质部的鱼鳞口；先将各小区底部土壤挖松整平，撒上一层湿树叶，树叶上平铺一层青冈木段并在各木段间接种蜜环菌栽培种，用细沙土填充木段间隙，以盖过木段为宜。按如上操作放入第二层青冈木段，然后覆土至与地平齐，最后盖上一层新鲜树叶或秸秆以保湿发菌。每个小区用2袋(聚乙烯塑料袋规格为28 cm×14 cm)蜜环菌栽培种。

1.2.3 天麻仿野生栽培试验 试验于2016年3月至11月在大方县九龙天麻开发有限公司天麻繁育基地(2 212.8 m，104.3°E，26.87°N)进行。每个小区面积为0.5 m2，天麻平均接种量300 g，每个蜜环菌供试菌株作为1个处理，每个处理用1袋蜜环菌栽培种，随机区组排列，重复3次。以陕西西乡食用菌研究所提供的A9菌株为试验对照。8个月后收获，统计产量。

1.2.4 农艺性状调查 天麻为无绿叶、无根的异养型多年生草本植物，主要生长在地下，地下块茎在繁殖季节提供养分抽薹、开花、结实后腐烂消亡，完成世代更替，因此本研究对红天麻地下块茎产量以及相关农艺性状指标的调查仅选取地下块茎部位。具体性状指标为块茎厚度、长度、宽度、长宽比、点状横环纹环数、环间距、肚脐眼直径、箭芽长度。

1.2.5 天麻蒸制 取新鲜天麻，按25～50 g、50～100 g、100～150 g、大于150 g四个等级分档后，洗去表面脏物及泥土，放于蒸笼中蒸制不同时间。以单个天麻重量计，25～50 g大火蒸10 min，50～100 g大火蒸15 min，100～150 g大火蒸20 min，大于150 g大火蒸30 min，蒸制结束后置于干燥箱中55 ℃恒温干燥至含水量15%以下(期间取出发汗2次)，取出称重，计算药材折干率。

1.2.6 天麻有效成分含量测定 按中国药典2015版[22]天麻炮制项下的要求进行天麻样品处理、有效成分含量测定。

1.2.7 数据统计与分析 使用excel2007、spss20.0、origin8.0进行试验数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同蜜环菌菌株栽培种生长以及菌材培养情况比较

观察记录各蜜环菌栽培种的生长情况以及对青冈菌材的培养情况(表2)。由表2可知，蜜环菌MHJ-1栽培种的生长速度最快、满袋时间最短，且菌索粗壮、洁白，与菌材共培养4个月后，菌材表面4/5布满菌索，菌索入侵菌材木质部深达5.2 cm，培养效果最好。与对照菌株A9相比，MHJ-1、MHJ-3、MHJ-6、MHJ-7及MHJ-8这6株菌株从生长情况及满袋天数分析，均为比较优良的菌株。尤其是菌株MHJ-1在菌袋中的菌索直径达4～5 mm，培养22 d后菌索已长满袋壁，看不清内部树枝；其次为菌株MHJ-3、MHJ-6。但各菌株是否有利于天麻生长主要取决于田间试验结果。

表2 不同蜜环菌菌株栽培种生长及对青冈菌材的培养效果

2.2 不同蜜环菌处理对红天麻农艺性状的影响

红天麻的环间距、箭芽长度、点状横环纹环数在6个不同蜜环菌处理间差异不显著，可作为品质控制的性状指标，其他农艺性状存在一定差异。其中，菌株MHJ-1栽培的天麻块茎长度、宽度、长宽比、肚脐眼直径均值均最大，但与对照菌株A9差异不显著；菌株A9培养的天麻块茎厚度均值最大，为46.69 mm，块茎长度、宽度、长宽比、肚脐眼直径均值仅次于菌株MHJ-1。菌株MHJ-8栽培的天麻块茎长度、宽度、长宽比、厚度、肚脐眼直径均值最小，其中块茎长度、宽度、厚度、肚脐眼直径极显著低于对照菌株。在块茎长度、厚度、长宽比三个农艺性状方面，菌株MHJ-1、A9明显优于菌株MHJ-3、MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8，详情见表3。

表3 不同蜜环菌菌株处理的红天麻的主要农艺性状比较

2.3 不同蜜环菌菌株处理对红天麻产量的影响

从表4可以看出，在红天麻的仿野生栽培试验中，菌株MHJ-1的伴栽效果最佳，鲜品平均产量达8.78 kg/m2，与对照菌株A9存在显著差异；干品平均产量为2.57 kg/m2，与对照菌株A9差异不显著，与其余菌株差异极显著；折干率仅次于对照菌株A9。菌株MHJ-3、MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8伴栽的天麻干品产量极显著低于菌株MHJ-1及菌株A9，其中菌株MHJ-8的伴栽效果最差，鲜品平均产量、折干率、干品产量均最低。从伴栽红天麻的鲜品产量、折干率、干品产量三个方面考虑，菌株MHJ-1优于其他菌株。

表4 不同蜜环菌菌株处理的红天麻的产量分析

2.4 不同蜜环菌菌株对各级红天麻质量及比例的影响

将收获后的鲜天麻按白麻、箭麻、不同等级称重得表5、表6。由表5、表6可以看出：菌株MHJ-1培养的菌材伴栽天麻箭麻产量最高，达7.76 kg/m2，与对照菌株A9间差异不显著，所占比例仅低于A9菌株0.01%；其一级、三级麻所占比例最大。菌株A9伴栽的天麻鲜品箭麻质量为7.38 kg/m2，显著高于菌株MHJ-3、MHJ-6，极显著高于菌株MHJ-7、MHJ-8伴栽的天麻；箭麻所占比例最大，与菌株MHJ-1、MHJ-3差异不显著，但极显著高于菌株MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8的箭麻占比。菌株MHJ-6伴栽的天麻鲜品箭麻质量为6.24 kg/m2，所占比例为83.96%；其中，二级天麻所占比例最大，为31.80%。菌株MHJ-8伴栽的天麻中，四级天麻及白麻所占比例最大，分别为23.30%、19.47%。

表5 不同蜜环菌菌株对红天麻大小及比例的影响

表6 不同蜜环菌菌株对各级红天麻所占比例的影响

天麻根据块茎的质量划分等级销售，本研究将收获的天麻分为箭麻和白麻(块茎质量<25 g)，又根据天麻块茎大小将箭麻分为四个等级，其中一级天麻块茎质量大于150 g，二级天麻块茎质量150～100 g，三级天麻块茎质量100～50 g，四级天麻块茎质量50～25 g。2017年底，鲜品红天麻“一级”价格80元/kg，“二级”60元/kg，“三级”45元/kg，“四级”30元/kg，白麻60元/kg。按红天麻各等级比例以及不同等级价格，计算每平方米产值(表5)。由表5可知，菌株MHJ-1、A9、MHJ-3、MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8伴栽的天麻每平方米产值分别为464.10、445.57、400.28、395.37、351.35、333.28元。菌株MHJ-1培养的天麻每平方米产值与菌株A9无显著差异；但菌株MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8培养的天麻产值极显著低于菌株A9，菌株MHJ-3伴栽的天麻产值显著低于对照菌株A9。就天麻产值而言，菌株MHJ-1优于其他菌株。

2.5 不同蜜环菌菌株对红天麻质量的影响

根据2015版国家药典规定，天麻干燥块茎醇溶性浸出物含量不得少于15.0%，总灰分含量不得超过4.5%，水分含量不得超过15.0%，对羟基苯甲醇(C7H8O2)和天麻素(C13H18O7)的总含量不得低于0.25%。从表7可以看出，菌株MHJ-1、A9、MHJ-3、MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8培养的天麻块茎醇溶性浸出物含量均大于15.0%，总灰分含量均小于4.5%，水分含量均小于15.0%，对羟基苯甲醇与天麻素总含量均高于0.25%，符合国家药典要求。

表7 不同蜜环菌菌株对红天麻主要成分含量的影响

从表7可以看出，菌株MHJ-1伴栽的天麻醇溶性浸出物含量最高，为29.24%，高出国家药典标准要求的14.24%，极显著高于其他菌株培养的红天麻醇溶性浸出物含量；水分含量最低，为9.84%，极显著低于其他处理。对照菌株A9的灰分含量最低，为1.83%，极显著低于其他菌株。菌株MHJ-1天麻素峰面积最大(图1)，天麻素含量最高，达0.946%，与对照菌株A9差异极显著；对羟基苯甲醇含量为0.193%，极显著低于对照菌株A9，但仅次于菌株A9；天麻素与对羟基苯甲醇总含量最高，为1.140%，是国家药典标准要求的4.56倍，极显著高于对照菌株。菌株A9伴栽的红天麻对羟基苯甲醇峰面积最大(图1)，含量高达0.250%，与其他处理差异极显著。菌株MHJ-8伴栽的天麻醇溶性浸出物含量最低，为19.83%；天麻素含量、对羟基苯甲醇含量、天麻素与对羟基苯甲醇总含量均最低，分别为0.318%、0.143%、0.461%。根据红天麻的醇溶性浸出物含量、天麻素与对羟基苯甲醇总含量，菌株MHJ-1伴栽的天麻质量最好。

图1 不同蜜环菌伴栽的红天麻的天麻素、对羟基苯甲醇检测图谱(高效液相色谱法)Fig.1 The fingerprints of gastrodin and 4-Hydroxybenzyl alcohol in G. elata Bl. f. elata between different A. mellea strains employed to high performance liquid chromatography (HPLC)

3 讨 论

天麻仿野生栽培试验结果表明，不同的蜜环菌菌株伴栽红天麻，会对其农艺性状有不同的影响。菌株MHJ-1培养的天麻块茎长度、宽度、肚脐眼直径、长宽比均值均高于对照菌株A9，但未表现出差异性。红天麻主要农艺性状的比较分析显示，点状横纹环数、箭芽长、环间距在几个蜜环菌菌株间没有差异；块茎长度、宽度、长宽比、肚脐眼直径、厚度差异不显著，属于较稳定的性状，这与王丽等[17]的研究结果相符。

从天麻仿野生栽培试验结果可以看出，不同确蜜环菌菌株会显著影响天麻的产量以及各级天麻质量、比例。生物学特性优良的菌株MHJ-1和A9菌索粗壮、生长速度快、满袋时间短、菌索分支多，对青冈菌材的侵染效果好，伴栽红天麻的效果也最佳。这与王秋颖等[18]、陈明义等[19]、孙士青等[5，23]的研究结果基本相符，即天麻产量与蜜环菌菌株的生长速度正相关。菌株MHJ-1伴栽的天麻采收后的鲜品产量是播种前的14.63倍，其伴栽效果优于对照，且存在显著差异；一级麻、三级麻所占比例最大，分别为13.01%、29.85%，但与对照菌株A9差异不显著。菌株MHJ-1培养的天麻每平方米产值为464.10元，极显著高于菌株MHJ-7、MHJ-8，显著高于菌株MHJ-3、MHJ-6，高出对照菌株A9 18.53元/m2，但产值无显著差异性。

从天麻仿野生栽培试验结果可看出，不同蜜环菌菌株伴栽的红天麻有效成分含量不同。菌株MHJ-1伴栽的天麻醇溶性浸出物含量、天麻素含量、对羟基苯甲醇与天麻素总含量均最高，且与其他菌株差异极显著。以对羟基苯甲醇、天麻素总含量和醇溶性浸出物含量为指标，菌株MHJ-1伴栽的红天麻质量最好。

综上所述，天麻的农艺性状、产量以及质量与蜜环菌菌株的生长速度及长势呈正相关，即生长速度快、满袋时间短、菌索分枝多、粗壮洁白、长势旺盛的蜜环菌菌株有利于青冈菌材的培养，使用该菌及菌材培养的红天麻不仅对羟基苯甲醇与天麻素总含量、醇溶性浸出物含量高，品质好，而且产量高，产值高。本研究中菌株MHJ-1对天麻产量、质量的影响优于菌株A9的原因，可能是菌株MHJ-1为野生蜜环菌子实体分离纯化而得，且从未用于天麻栽培，这与王晓玲等[24]的研究结果相符。

在开展药用植物品种选育以及品质评价时，不仅要考虑产量、产值，还要考虑药效。雷有成等[25]报道，不同等级天麻的天麻素含量不同，天麻素含量是衡量天麻等级的一个指标。在下一步的系统选育及质量控制中，将深入研究不同的蜜环菌菌株与天麻其他化学成分之间的相关性，建立多指标评价体系，从而系统评价不同的蜜环菌菌株对天麻产量、质量的影响。