陈勇辉 叶若松 龚金荣 曹根凤

摘 要 为开发一种高效、环保、多功能的荷叶促生长剂，以荷叶为试材，研究稻瘟菌激活蛋白对荷叶生长及其抗氧化活性成分含量的影响。结果表明，经浓度为2.5 ?g·mL-1稻瘟菌激活蛋白处理后，荷叶发芽率相比对照组提高了33%，培养30 d后荷叶数量较空白处理增加79%;同时，经浓度为2.5 ?g·mL-1稻瘟菌激活蛋白处理后，与空白对照组相比荷叶中总黄酮、可溶性糖及生物碱含量分别提高72.2%、56.1%及59.1%，荷叶提取物的羟自由基清除率为87.3%。可見，稻瘟菌激活蛋白可有效促进荷叶生长，增强其抗氧化活性。

关键词 稻瘟菌;激活蛋白;荷叶;促生长;抗氧化

中图分类号：S567.239 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.32.077

荷叶（Nelumbinis folium），又称莲叶，在我国南北方均有分布，有上千年的食用历史。荷叶营养丰富，除含有丰富的碳水化合物、脂类、蛋白质等化学成分外，还含有黄酮类、酚酸类、生物碱类等多种活性成分[1-2]。传统医学界认为荷叶性味苦寒，具有清解暑热、凉血止血的作用。现代研究表明，荷叶中活性成分具有降压降脂、抗病毒、抗氧化、抗衰老等多种功效[3-6]。

荷叶作为重要的经济作物，提高其品质可创造更多经济价值。植物免疫诱抗剂具有促进植物生长、激活自身免疫系统提高抗病能力等作用，成为近年来生物防治的研究热点。交链孢菌、稻瘟菌和镰刀菌等多种真菌中存在一类具有诱导植物抗性、提高植物免疫力的蛋白免疫诱抗剂，称为激活蛋白[7-8]。与宿主细胞表面某些激发子受体结合，通过胞内信号分子级联放大，激活植物自身免疫系统，增强植物抵御病虫害和自然胁迫的能力[9]。同时还具有提高发芽势、促进植物生长的特殊功能，故被认为是一种环境友好型新型多功能生物农药[10]。

为明确激活蛋白在荷叶上的应用效果，使用激活蛋处理荷叶并评价其促生和提高荷叶品质的作用，旨在为植物免疫诱抗剂合理推广应用与荷叶的科学种植提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 稻瘟菌的培养与激活蛋白的纯化

在无菌环境中，在PDA固体培养基上接种挑取的稻瘟菌菌丝，培养箱中28 ℃培养3 d。转入28 ℃摇床中的PDA液体培养基中，一直到获得大量生长旺盛的菌丝体后收集菌丝，参考邱德文研究中的方法[11]，制备出植物激活蛋白母液2.5 mg·mL-1，存于冰箱中冷冻备用。

1.2 荷叶的培养与处理

荷叶种子平均分成3组，将种子进行去壳处理，分别在不同浓度激活蛋白缓冲液（0 ?g·mL-1、1 ?g·mL-1、

2.5 ?g·mL-1、5 ?g·mL-1和10 ?g·mL-1）中浸种6 h后，清水洗涤种子两次，于清水中25 ℃培养。7 d后移栽入营养土，水培培养，观察长势。荷叶幼苗用激活蛋白每7 d喷雾处理1次，30 d后取荷叶烘干磨成粉末，提取荷叶中活性成分。

1.2.1 荷叶总黄酮含量的测定

荷叶粉末加70%乙醇匀浆超声破碎后，在80 ℃水浴中回流2 h，冷却后过滤，取清液定容，用亚硝酸钠-硝酸铝比色法，于510 nm处测定吸光度。以芦丁为标样得到回归方程计算总黄酮含量，每项实验重复3次，对比不同浓度激活蛋白对荷叶黄酮含量的影响。

1.2.2 荷叶可溶性糖含量的测定

采用邢颖等的方法提取荷叶中可溶性糖，取荷叶粉末，按1∶20的比例加入蒸馏水，90 ℃水浴提取两次，每次2 h，抽滤，合并提取液。对比不同浓度激活蛋白对荷叶可溶性糖含量的影响[12]。

1.2.3 荷叶生物碱含量的测定

取荷叶粉末，按1∶40的比例加入90%乙醇，于80 ℃加热浸提2.5 h。加氯仿萃取静置，取水层滤液用氢氧化钠调pH至9～10。用紫外可见分光光度计在281 nm测定提取液中的荷叶生物碱吸光度，以荷叶碱为标样得到回归方程计算生物碱含量，对比不同浓度激活蛋白对荷叶生物碱含量的影响。

1.3 激活蛋白对荷叶羟基自由基清除作用的影响

采用的刘军波等的方法对荷叶成分进行提取，并使用水杨酸法测定经不同浓度激活蛋白处理后的荷叶对羟基自由基的清除率[13]。羟基自由基的清除率计算公式如式（1）所示。

（1）

其中，A0为空白对照的吸光值，Ax为加样品的吸光值，Ax0为不加显色剂H2O2时样品的吸光值。

2 结果与分析

2.1 不同浓度激活蛋白对荷叶种子发芽生长的影响

观察各组荷叶种子在相同环境及培育时间下的的发芽情况，结果如图1所示：对照组种子发芽率为63.3%;经浓度为2.5 ?g·mL-1的激活蛋白溶液处理的种子发芽率为84.4%;当激活蛋白浓度上升至10 ?g·mL-1时，发芽率下降至53.3%。由种子发芽率可知激活蛋白浓度为

2.5 ?g·mL-1时莲子发芽率最高，而激活蛋白浓度继续上升时种子发芽率降低，可能原因是相对较高浓度的激活蛋白对荷叶发芽率有抑制作用。

如图2所示，不同浓度激活蛋白处理的荷叶在相同条件下培养荷叶30 d后，激活蛋白处理组叶片数量与对照组比较也具有显著性差异。经浓度为2.5 ?g·mL-1的激活蛋白溶液处理的荷叶幼株，30 d时的叶片数量高出对照组79%。说明适当浓度的稻瘟菌激活蛋白对荷叶的生长也有明显的促进作用。

2.2 不同浓度激活蛋白对荷叶黄酮含量的影响

以芦丁为标准品绘制标准曲线，测得荷叶中黄酮浓度见图3。对照组荷叶中黄酮的浓度为24.98 mg·g-1;经浓度为2.5 ?g·g-1稻瘟菌激活蛋白处理后，荷叶中黄酮的浓度为43.02 mg·g-1;经浓度为10 ?g·mL-1稻瘟菌处理后，荷叶中黄酮浓度为18.33 mg·g-1。结果表明，2.5 ?g·mL-1激活蛋白溶液可有效提高荷叶中黄酮的含量，但经高浓度稻瘟菌激活蛋白处理过的荷叶中的黄酮反而降低，说明高浓度激活蛋白会抑制荷叶中黄酮的产生。

2.3 不同浓度激活蛋白对荷叶可溶性糖含量的影响

采用蒽酮比色法测定荷叶中可溶性糖含量结果见图4。未经激活蛋白处理的荷叶中可溶性糖含量为8.54 mg·g-1;

经浓度为2.5 ?g·mL-1稻瘟菌激活蛋白处理后，荷叶中可溶性糖的浓度为13.33 mg·g-1;而经浓度为10 ?g·mL-1稻瘟菌激活蛋白处理后，荷叶中可溶性糖浓度下降至

6.12 mg·g-1。结果表明，在一定浓度范围内激活蛋白能提高荷叶中可溶性糖的含量。

2.4 不同浓度激活蛋白对荷叶生物碱含量的影响

如图5所示，未经激活蛋白的荷叶中生物碱的浓度为0.164 mg·g-1;经浓度为2.5 ?g·mL-1稻瘟菌激活蛋白处理后，荷叶中生物碱的浓度为0.261 mg·g-1，经浓度为10 ?g·mL-1稻瘟菌处理后，荷叶中生物碱浓度为0.128 mg·g-1。结果表明，在一定浓度范围内激活蛋白对荷叶中生物碱的产生有一定促进的作用。

2.5 激活蛋白对荷叶提取物清除羟自由基的影响

经不同浓度稻瘟菌激活蛋白处理的荷叶提取物的羟自由基清除率如图6所示。对照组清除率为75.36%;经浓度为2.5 ?g·mL-1激活蛋白溶液处理的荷叶提取物清除率为87.3%，当经浓度为10 ?g·mL-1的激活蛋白溶液处理的荷叶提取物清除率为63.58%。实验结果表明，在一定浓度范围内，随着激活蛋白浓度的提高，可提高荷叶的羟自由基清除能力，从而提高荷叶抗氧化性。但高浓度激活蛋白会抑制荷叶羟自由基清除能力，可能是由于高浓度的蛋白会抑制荷叶中黄酮等抗氧化成分的产生。

3 结论

激活蛋白是从真菌中纯化出的一类具有诱导植物抗性的新型蛋白激发子，具有提高植物免疫力的作用。本试验使用激活蛋白溶液处理荷叶，并证明在一定浓度范围内，激活蛋白可以促进荷叶的生长，并提高荷叶中抗氧化活性成分的含量，从而提高荷叶抗氧化性。荷叶中黄酮类和生物碱类活性成分具有较高的药用价值和保健功能，使用激活蛋白可以提高荷叶中活性成分含量和抗氧化性，从而提高荷叶的品质。本研究结果不仅有利于荷叶产业的发展，也为激活蛋白的应用提供新的思路和方法，为开发新型绿色农药奠定理论基础。

参考文献：

[1] YANG D，WANG Q，KE L，et al.Antioxidant activities of variou sextracts of lotus （Nelumbo nu ficera Gaertn）rhizome[J].Asia Pac J Clin Nutr，2007，16（1）：158-163.

[2] 钟先锋，黄桂东.荷叶成分及功能的研究进展[J].食品与机械，2006，22（4）：138-141.

[3] Yoshiki KHA，Akihiro AH，Yasu MI，et al.Anti-HIVbenzylis oquinoline alkaloids and flavonoids from the leaves of Nelumbo nucifera ， and structure-activity cor relations with related alkaloids[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry，2005，13：443-448.

[4] Yuka O，Eri HO，Yukitaka FK，et al.Anti-obesity effect of Nelumbo nucifera leaves extract in mice and rats[J].Journal of Ethnopharmacology，2006，106：238-244.

[5] SU JR，Atul W，Kakali MH，et al.Antioxidant activity of Nelumbo nucifera （sacred lotus）seeds[J].Journal of Ethnopharmacology，2006，104：322-327.

[6] Lahl M，El MM，Hamamouchi J.Evaluation of antifungaland mollusuicidial activities of Moroccan Zizyphus lotus（L.）Desf[J].Ann Pharm Fr，2002，60（6）：410-412.

[7] ZHANG C，LIU X，QIU D，et al.Purification， crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the effector protein MoHrip1 from Magnaporthe oryzae[J].Acta Crystallographica，2013，69：460-462.

[8] WANG B，YANG X，ZENG H，et al.The purification and characterization of a novel hypersensitive-like response-inducing elicitor from Verticillium dahliae that induces resistance responses in tobacco[J].Appl Microbiol Biotechnol，2012，93：191-201.

[9] CHEN M，ZENG H，QIU D，et al.Purification and characterization of a novel hypersensitive response-inducing elicitor from Magnaporthe oryzae that triggers defense response in rice[J].PLoS One.2012，7（5）：e37654.

[10] CHEN M，ZHANG C，ZI Q，et al.A novel elicitor identified from Magnaporthe oryzae triggers defense responses in tobacco and rice[J].Plant Cell Rep，2014，33（11）：1865-1879.

[11] 邱德文.新型生物農药-植物激活蛋白[J].农村百事通，2012，2（2）：39-40.

[12] 邢颖，景艳芳.提取方法对荷叶多糖得率及抗氧化活性的影响[J].食品与机械，2020，36（6）：166-169.

[13] 刘军波，邹礼根，赵芸.荷叶营养成分及其水提取物抗氧化活性研究[J].浙江农业科学，2015，56（11）：

1791-1793.

（责任编辑：刘 昀）