王雨露， 许笑阳， 俞晓菡， 平 键,1b,2,3， 赵长青,1b,2,3

1 上海中医药大学附属曙光医院 a.肝病研究所； b.肝二科， 上海 201203； 2 上海市中医临床重点实验室， 上海 201203； 3 肝肾疾病病证教育部重点实验室， 上海 201203

肝细胞癌(HCC)为最常见的原发性肝癌，是全球第六大恶性肿瘤。大多数HCC发生在肝硬化患者中，全世界高达80%的肝癌归因于HBV、HCV感染。而在病毒感染率较低的西方国家，与酒精有关的肝病和非酒精性脂肪肝成为导致HCC的主要原因[1]。其他危险因素包括黄曲霉毒素、肥胖、原发性胆汁性肝硬化等[2-4]。HCC常在晚期时被发现，其恶性程度高，浸润和转移性强，因此被列为最致命的癌症之一。目前HCC的治疗包括外科手术方面取得了一些进展，但由于其发生缺乏可靠的生物标志物，且异质性遗传和表观遗传学改变均不明确，预后不良，患者术后5年生存率仍难以令人满意。在这种难治性恶性肿瘤发病率稳步上升的背后，能否早期诊断与及时治疗对取得远期疗效具有重要意义。氧化应激学说是HCC发生发展机制研究的重要学说之一，证据显示自噬在HCC中发挥重要作用，且与氧化应激关系紧密。但二者在HCC中相互调节的机制至今尚未十分明确。本文主要对近年来氧化应激和自噬在HCC发生发展过程中的作用进行综述。

1 自噬与HCC

自噬是维持细胞稳态的重要机制，指细胞利用溶酶体，降解自身受损、变性或衰老的大分子物质，以及细胞器的自我消化过程。当细胞发生自噬后，在自噬相关基因的调节下，细胞通过单层或双层膜，包裹待降解的细胞质或细胞器，形成囊泡状的自噬体。自噬体再与溶酶体发生融合形成自噬溶酶体，由溶酶体内的一系列水解酶，降解其内所包裹的内容物，以实现细胞自身代谢和能量更新[5]。

自噬诱导的Ⅱ型细胞程序性死亡，除了在正常条件下能够维持细胞稳态，还在帮助细胞对抗氧化应激的防御机制中发挥关键作用。在机体能量不足或其他压力条件下，通过自我降解清除受损细胞器和有害物质，来获取细胞生存必须的营养和能量，实现细胞内成分循环，以促进细胞存活[6]。相反，自噬失调则会对人类健康造成严重后果，如压力过度引发的自噬会诱导细胞凋亡，导致细胞失去活性。尤其在恶性肿瘤的发生发展过程中，自噬可能影响包括增殖生长和转移在内的所有致病步骤。因此，自噬是一把“双刃剑”[7]。

自噬在癌症中亦扮演着双重角色，既作为抑癌因素抑制肿瘤，也作为促癌因素促进肿瘤发生，参与肿瘤转移[8]。研究[9]认为，正常情况下自噬是一种抑制肿瘤发生的机制，通过清除受损细胞器，降低细胞内压力从而减少癌变；或通过介导细胞凋亡、抑制炎症和免疫反应来清除癌细胞，以阻止癌症的进展；同时，调控内皮细胞自噬能够抑制肿瘤血管的生成。相反，一旦癌症发生，自噬将转为促癌机制，通过为肿瘤细胞提供营养能量和增强肿瘤细胞抵抗放化疗能力，来维持肿瘤细胞的稳定性，促进肿瘤发展[10-11]。

1.1 自噬对于肝癌的抑制作用 在肝癌中，肝细胞降解主要依赖自噬，清除过量聚集的蛋白质、脂质和受损的线粒体，以防止过多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成[12]导致氧化应激。HCC的进展与持续性炎症刺激高度相关，自噬通过抑制炎症来阻止这种进展，而抑制自噬则引起炎症水平升高。相关的动物实验[9,13]显示，与野生型对照相比，在感染性休克的ATG16L1敲除小鼠中，发现缺乏自噬反应，且与炎症相关的IL-1β和IL-18细胞因子水平升高，这证明了自噬抑制炎症的能力。另有研究[14]表明，在人肝癌组织中，能够抑制自噬的趋化因子CXCL17表达明显升高，这与肝癌组织学分期及预后不良有关；在体外实验中，CXCL17的高表达也能促进细胞增殖和迁移，而沉默CXCL17诱导自噬，则发现肿瘤体积减小伴重量减轻，提示自噬减轻肿瘤发展。Beclin1是一种与肝癌相关的自噬蛋白，并与肿瘤复发有关，Beclin1基因敲除的小鼠在胚胎期致死，而异种Beclin1小鼠则发展为自发性肝癌[15]。该蛋白在人肝癌组织中被观察到表达下降，比在正常肝细胞中低，这也提示自噬具备肿瘤抑制作用[16]。一项用肾上腺素治疗肝癌小鼠的实验[17]显示，肾上腺素通过激活肾上腺素能受体，破坏Beclin1/VPS34/ATg14复合物来抑制细胞自噬，引起肝损伤加重，导致肿瘤体积增大伴数量增多。自噬还被证明有助于增强IFNγ来抑制癌细胞扩散，IFNγ多向性细胞因子可促进肿瘤细胞抗病毒和抗增殖，在HCC细胞中刺激自噬细胞体形成以抑制细胞生长。沉默自噬能够消除IFNγ的抑制作用，这表明自噬具有抗肿瘤活性[18]。

多个自噬靶向的miRNA包含自噬调节基因也可能参与HCC过程。在HCC中，抑癌miR-7水平显著下调，其通过上调靶向mTOR通路增强自噬活性，导致癌细胞增殖减少。抑癌miR-185在人肝癌细胞株HepG2中，通过转染上调自噬活性，引起细胞周期阻滞。而miR-375在肝癌细胞株和组织中均下调，其通过下调肝癌细胞自噬相关蛋白(autophagy related protein, ATG)7抑制LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化，从而抑制肝癌细胞自噬。在miR-375过表达的裸鼠实验中证实肿瘤生长速度及大小显著降低[19]。以上研究为支持自噬对肝癌的抑制作用提供了证据。

1.2 自噬对于肝癌的促进作用 HCC发生过程中氧化应激导致大量ROS堆积，自噬相关蛋白p62通过激活Keap1/Nrf2系统防御氧化应激，参与蛋白聚集螯合及凋亡。相关研究[20]表明，肝脏中的肿瘤抑制蛋白DDX5与p62结合，能够干扰p62/TRAF6的相互作用，从而诱导自噬，DDX5在人肝癌组织中的表达低于非肿瘤组织，提示自噬引起p62蛋白过度累积，继而促使肝癌细胞生长和增殖。低氧诱导的自噬在肝细胞和肝癌细胞中依赖于缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF)1α，其上调BNIP3及BNIP3L蛋白与BCL-2蛋白的结合，从而抑制BCL-2和Beclin1之间的相互破坏作用，诱导细胞自噬以在低氧条件下存活。此外，在人肝癌细胞株中，低氧诱导的早期生长反应基因EGR-1的上调诱导自噬，促进HCC细胞迁移。自噬还可以通过释放、降解损伤相关模式分子来调节炎性免疫应答，其中自噬介导的高迁移率族蛋白(high mobility group box 1, HMGB1)在坏死或凋亡的肝细胞中被释放出来，诱导细胞存活和调控凋亡程序。HMGB1的细胞内易位促进了其与胞质中mtDNA的相互作用，以共同激活TLR9信号通路，促进肿瘤生长[21-22]。

自噬在HCC转移中也发挥了促进作用，肿瘤转移过程中发现自噬的表达上调。当原发性肿瘤生长并遭遇恶劣的微环境时，部分肿瘤在循环系统和淋巴系统内发生逃逸，进入全身循环，定位于远端器官。另外，自噬能够引起细胞黏附信号的改变，引发癌细胞侵袭和迁移[23]，HCC的自噬通过上调上皮间质转化的表达来促进转移。研究[24]表明，通过沉默Beclin1和ATG5抑制肝癌肺转移模型的自噬，可显著降低肝癌向肺远端转移。

2 氧化应激与HCC

氧化应激是指细胞氧化还原失衡，引起过量ROS堆积，或抗氧化能力下降，导致机体氧化物和抗氧化系统之间失衡而造成的应激状态。ROS是体内氧化还原反应的正常产物，由正常代谢产生或由吸烟、辐射、粉尘等外源因素诱导，引起脂质过氧化反应，导致DNA链断裂，氧化生物膜和组织中的分子，造成损伤。然而，由于机体能够在一定程度上清除ROS，低通量ROS介导的氧化还原信号可调节细胞周期和细胞增殖，并发挥核心作用；高通量ROS则引起靶分子的不可逆改变，从而损伤细胞，引起氧化还原稳态的持续失衡，最终致使细胞死亡[25]。这显示出保持氧化还原平衡的必要性。

在癌症中，氧化应激水平通常会增加，不同的增殖信号如生长因子受体与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的结合，引起ROS产生增多[26]。DNA氧化损伤产生的DNA突变和不受控的细胞增殖属于典型的ROS致瘤。有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路作为促细胞增殖和存活的重要通路之一，可通过氧化间接发挥调节作用，抑制MAP激酶磷酸酶Mkp3，或抑制MAPK亚家族成员Mkk6[27]。这证实一系列氧化还原反应影响激酶的活性，并参与细胞增殖相关通路的调控，促进肿瘤发生。

肝癌细胞的高增殖能力和持续性炎症，都与氧化应激有关。Nrf2作为氧化还原稳态的主要调节因子，在HCC中发挥重要作用。缺乏Nrf2的小鼠更易受到环境和细胞内压力的影响，导致DNA损伤而促进癌症发生，激活Nrf2则可抑制肿瘤。在肝癌中，HBV基因组编码X蛋白(HBx)与线粒体中ROS的增加相关[28]；体外感染HCV的人肝癌细胞，和表达HCV核心蛋白的转基因小鼠肝脏，均观察到氧化DNA损害即8-氧化鸟嘌呤(8-oxyoguanine, 8-oxoG)水平增加[29]，HCV介导的ROS改变线粒体功能；酒精引起的氧化应激失衡表现为黄嘌呤氧化酶促进ROS[30]；由三酰甘油限速酶释放的脂肪酸能够激活过氧化物酶体增殖物激活受体，从而影响抗氧化反应，也影响着肝癌的发展[31]。氧化应激一方面直接在DNA上形成8-oxoG或脂质过氧化引起畸变，另一方面通过表观遗传机制促进肝癌发生。肝癌细胞中的位点特异性表观遗传学改变，包括H2O2处理引起的E-cadherin启动子甲基化，和HBV诱导的线粒体ROS积累而发生的细胞因子信号抑制因子SOCS3的甲基化[32]。总的来说，ROS水平的增加是基因遗传和表观遗传突变及增殖信号的原因，抗氧化剂导致的ROS失衡会引起细胞死亡。

3 自噬与氧化应激的相互作用及其调控机制

氧化应激可诱导自噬，也可诱导凋亡或坏死。从细胞内稳态的角度来看，自噬是对氧化应激的一种重要反应，ROS又可以通过多种途径激活自噬(图1)。Nrf2-Keap1系统是抗氧化应激的主要防御机制之一，HCC中Nrf 2的激活可能是独立发生的，也可能依赖于p62积聚和自噬途径激活。抗氧化蛋白Nrf2通过自噬上调，自噬蛋白p62磷酸化后与Nrf2抑制蛋白Keap1结合，引起Nrf2释放，Nrf2进一步结合sMaf、JunD、ATF4、ARE形成复合物来调节抗氧化反应。通过p62的过量积累，Nrf2的持续激活直接促进了肿瘤发展，证实自噬诱导抗氧化通路的激活。Nrf2的持续激活在促进自噬缺失的肝肿瘤中起关键作用，这在ATG5肝脏特异性敲除小鼠中亦得到证实，自发进展为炎症、肝纤维化和肝脏肿瘤，在没有Nrf2的情况下这种现象被消除[33]。

ROS介导的自噬与HCC的生存机制和压力条件相关，自噬活性和ROS在缺血再灌注损伤期间均增加，利于HCC细胞的增殖和存活[34]。自噬抑制ROS产生的关键机制是通过自噬去除受损的线粒体，线粒体可以降解肿瘤抑制因子p53，线粒体损伤则导致p53的积累。其选择性吞噬BCL2相互作用蛋白3(BNIP3)和NIP样蛋白X(Nix)衔接蛋白，与E3泛素连接酶结合。随着营养缺乏，HIF作为缺氧反应的主要调节因子，能够促进BNIP3和Nix表达等自噬关键蛋白的转录[35]。Parkin蛋白敲除小鼠肝细胞增殖模型表明，Parkin蛋白可抑制HCC的发展。研究[36]发现，在ROS介导的乙醇致肝癌作用下，Parkin依赖的线粒体被激活。因此，在Parkin敲除的小鼠肝脏中，酒精诱导广泛的线粒体损伤和氧化应激，表现出线粒体自噬。并且在功能障碍线粒体中与乙醇处理大鼠肝脏中积累的8-oxoG呈高度一致性[37]。在慢性酒精性肝损伤中，显示自噬对CYP2E1依赖性氧化应激反应的细胞保护作用[38]。

文献[39]显示，氧化应激诱导线粒体自噬还可以抑制HCC迁移。相反，过度激活自噬则可能导致自噬细胞死亡。H2O2介导的ATG4被抑制，不能清除LC3，从而促进其与自噬体p62结合，进而促进自噬水平增高。此外，ROS还可影响参与自噬的其他信号通路，自噬关键分子mTOR激酶的激活被Akt和MAPK信号通路抑制，蛋白激酶Akt诱导促进生存的自噬，维持HCC中p53的降解和核因子NF-κB的表达[40]；而负调控mTOR的通路如对氧化应激敏感的蛋白激酶AMPK和p53信号通路促进自体吞噬[41]。在应激条件下，依赖于ROS的p38的激活，也是抑制癌细胞自噬激活的必要条件[42]。综上，自噬与遗传改变的信号通路PI3K/Akt/mTOR/Ras/Raf/MAP激酶和Wnt-β连环蛋白通路交互，其中大部分由ROS触发。以上进一步表明了ROS与自噬之间的复杂联系在受遗传和慢性环境损害影响时可能促进HCC进展(图1)。

4 结语

目前，对肝癌细胞内和细胞外不同刺激条件下参与自噬复杂协调反应的应激信号通路了解甚少。氧化应激作为与HCC相关的一个关键环节，与导致HCC发病的多种环境风险因素相关。在氧化应激和营养缺乏等应激条件下，自噬也是与其他应激反应通路协调运行的重要途径，在HCC中扮演双重角色。自噬对HCC的发生发展既有促进作用，也有抑制作用，受损的自噬产生应激反应，增加发生肝细胞损伤和癌症病变的风险。氧化应激与自噬的相互作用对HCC的治疗效果具有很大影响，通过调节p62介导的Nrf2-Keap1这一关键信号通路，自噬直接参与调节氧化应激反应。p62对Nrf2- keap1通路的交互调节作用已被确定为HCC的潜在抗癌治疗靶点[43]。进一步阐明氧化应激与自噬在HCC中的作用机制还需要更深入的研究，改善肿瘤氧合或抑制缺氧诱导的自噬信号可能是潜在的治疗途径。