陆 谦, 朱李瑢, 程 欣, 黄 华, 陈 钟

1 南通大学附属医院 a.肝胆外科； b.病理科， 江苏 南通 226001；2 南通市通州区人民医院 普外科， 江苏 南通 226300

据2018年全球癌症统计数据显示，原发性肝癌是全球第6大常见的癌症并且是第4大癌症死亡的原因[1]。肝细胞癌(以下简称肝癌)是最常见的原发性肝癌类型，占总发病人数的75%～85%[1-2]。目前研究[3-4]表明，基因的异常表达参与了肝癌的发生发展，并且针对某些异常表达基因的靶点治疗是未来肝癌精准治疗的方向。蛋白酶体抑制剂通过抑制蛋白酶体的功能为癌症治疗提供了独特的方法[5]。人蛋白酶体β亚基4型(PSMB4)是20S蛋白酶体的一个亚基，被认为是第一个具有致癌特性的蛋白酶体亚基，可以促进体内癌细胞的存活和肿瘤生长[6]。然而，PSMB4在人类肝癌组织中的表达及其预后关系尚未被研究。本研究拟检测PSMB4在肝癌组织及正常肝组织中的表达情况，分析其表达情况与肝癌患者临床病理参数以及生存时间之间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2009年1月-2012年10月在南通大学附属医院普通外科行肝癌根治性手术切除患者的临床及随访资料，共有105例肝癌组织及25例正常肝组织进行了免疫组化评分。Child-Pugh B级及C级、手术切缘阳性、术前有放化疗史以及临床资料不完全的病例排除。随访截止时间2018年6月。手术后至死亡或最后随访时间定义为总生存时间。另收集了2017年1月-10月在南通大学附属医院行手术治疗的8例患者的肝癌及癌旁组织样本，用于Western Blot分析。所有资料的获取均获得了患者的知情同意，实验流程通过南通大学附属医院伦理委员会批准(批号：2018-L006)。

1.2 Western Blot分析 将8例新鲜组织在匀浆缓冲液中匀浆，并在4 ℃、12 000 ×g离心30 min后收集上清液。依据Bio-Rad法测定蛋白质浓度，并调节至相同的蛋白浓度。利用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白，并转移至PVDF膜。使用5%脱脂奶粉封闭，用含有Tween-20的Tris缓冲盐水洗涤，加入PSMB4抗体(1∶1000)，抗GAPDH(1∶2000)孵育过夜。TBST洗膜后，加入相应的二抗(1∶500)再次孵育4 h。最后，加入ECS显色液，显示与抗体相结合的蛋白条带。

1.3 免疫组化染色及评分 将稀释的PSMB4单克隆抗体(1∶200)均匀滴在包含105例肝癌组织及25例正常肝组织的组织芯片上，4 ℃湿盒中孵育过夜。然后均匀地滴加稀释的相应二抗(1∶100)，室温放置30 min。接着使用显微镜对每个样本捕获3个代表性的图像，并邀请资深的病理科医生进行双盲读片。PSMB4的免疫染色评分为0～9分，并以阳性染色的肿瘤细胞所占百分比(0～9%，0分；10～25%，1分；26%～50%，2分；>50%，3分)和染色强度(无染色，0分；轻度染色，1分；中度染色，2分；重度染色，3分)的乘积作为判断标准。总评分>3分定义为PSMB4高表达组织，总评分≤3分定义为PSMB4低表达组织。

2 结果

2.1 一般资料 105例肝癌患者根据PSMB4的表达水平可分为高表达组(n=57)和低表达组(n=48)。2组间HBV感染、肿瘤最大直径、肿瘤分化程度、TNM分期比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表1)。

2.2 PSMB4表达情况

2.2.1 免疫组化染色情况 105例肝癌组织中，57例(54.29%)显示为 PSMB4 高表达，48例(45.71%)显示为PSMB4低表达；而在25例正常肝组织中8例(32%)显示为PSMB4高表达，17例(68%)显示为PSMB4低表达或不表达，2组表达情况比较差异有统计学意义(χ2=4.011,P<0.05)。PSMB4染色主要分布于细胞浆和细胞核内，染色呈棕色及棕黄色颗粒样(图1)。

表1 肝癌组织中PSMB4的表达水平与各种临床病理参数的关系(例)

注：a，低分化肝癌组织强阳性；b，中分化肝癌组织中阳性；

c，高分化肝癌组织弱阳性；d，正常肝组织阴性。

图1肝癌及癌旁组织的PSMB4免疫组化染色结果(×200)

2.2.2 Western Blot检测结果 8例新鲜肝癌及癌旁组织样本的Western Blot检测结果显示，有7例样本中肝癌组织的PSMB4蛋白表达水平明显高于癌旁组织(P值均<0.05)(图2)。

2.3 Cox风险比例模型分析结果及生存分析 截至随访时，105例患者中死亡63例，生存42例。Cox单因素和多因素风险回归模型分析显示，患者的5年生存状态与肿瘤大小、转移情况、分化程度、TNM分期以及PSMB4表达水平相关(P值均<0.05)，其中肿瘤转移和PSMB4高表达是肝癌患者的独立危险因素(P值均<0.001)(表2)。

Kaplan-Meier生存曲线进一步分析显示，PSMB4高表达组患者5年生存率明显低于PSMB4低表达组(27.6% vs 79.2%,χ2=22.96,P<0.05)(图3)。

表2 Cox风险回归模型分析肝癌患者5年生存情况与临床病理参数的关系

注：HR,风险比；95%CI,95%可信区间。

3 讨论

肝癌是我国第4大常见恶性肿瘤，由于其起病隐匿、转移早，多半患者在临床确诊时已经错过最佳的手术切除机会[7-8]。目前，以索拉非尼为代表的分子靶向药物为晚期肝癌的治疗提供了一种新手段。但是，索拉非尼除了对癌细胞起作用外也对正常细胞产生副作用，所以肝癌的分子治疗仍然面临巨大的挑战[9-10]。因此，深入探究肝癌发生的分子机制，寻找准确预测肝癌发生和预后的分子标志物，采取及时有效的预防和治疗措施，对肝癌患者的生存时间有着重要的意义。

蛋白酶体是一种多亚基复合物，可选择性地降解80%～90%的细胞内蛋白，并参与几乎所有的细胞过程[11]。PSMB4即26S蛋白酶体β亚基4型，此基因位于1q21，mRNA为925 bp，含有7个外显子, 编码29 kD大小的蛋白，主要分布在细胞核和细胞浆中[12]。PSMB4在26S蛋白酶体的20S核心颗粒的生物形成中起稳定和成熟的作用，并且在肿瘤细胞蛋白酶体β亚基上丝氨酸残基的磷酸化较低，使得它有望成为肿瘤的生物标志物[13]。最近研究[12,14-15]发现PSMB4在多种肿瘤中呈高表达，如神经胶质瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、皮肤黑色素瘤等。本研究也发现PSMB4在肝癌组织中的表达显著高于癌旁及正常肝组织，PSMB4表达增高的肝癌患者的生存时间少于PSMB4低表达的患者。此外，研究还发现PSMB4表达水平与最大肿瘤直径、肿瘤分化和TNM分期有关，表明PSMB4表达增高可能促进了肝癌的进展。不仅如此，根据先前的研究[16-17]报道，PSMB4的表达可以在HBV-X基因转染的HL-7702肝细胞和p21-HBx转基因小鼠的肝癌模型中显著增加。同样，本研究也发现PSMB4表达增高与患者HBV感染情况有关，因此，推测PSMB4基因在HBV慢性感染导致肝癌发生过程中起着重要的推动作用。

综上所述，本研究发现PSMB4的表达水平与肝癌发生发展及其预后密切相关。因此，PSMB4基因有可能成为肝癌治疗的潜在靶点和预后标志物。然而，肝癌的发生发展是一个非常复杂的过程，PSMB4作为一个促癌基因在其中的具体作用机制尚未完全阐明，还有待进一步的深入研究。