谢重驹，马文敏，杨美琼，劳群秀，陈孟循

(南方医科大学附属佛山市妇幼保健院生殖中心，佛山 528000)

激素替代(HRT)方案是冻融胚胎移植(FET)常用的内膜准备方案，该内膜准备方案具有高度的灵活性，日益受临床工作者青睐。与自然周期不同，HRT方案是通过外源性添加雌激素及孕激素使下丘脑-垂体-卵巢轴受到抑制，通过人工模拟的方式使内膜获得同步化改变。充足的雌激素才能诱导足够的孕激素受体[1-2]，对胚胎着床产生重要作用。随着辅助生殖技术的不断发展，诸多文献表示在鲜胚移植周期中，高水平的雌激素对胚胎着床产生不利影响，如溶黄体效应、对子宫内膜分泌的干扰、子宫收缩波增强、内膜容受窗变窄等。

雌激素在内膜生长及胚胎着床中起着重要作用，是HRT周期中的一个可控变量。本研究旨在探讨HRT-FET周期中内膜转化日血清E2的水平与妊娠结局的关系，期望对临床工作带来一定的指导作用。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2016年1月至2019年4月在佛山市妇幼保健院生殖中心行FET的1 398例患者共1 502周期的临床资料。纳入标准：年龄≤37岁；胚胎冷冻方法为玻璃化冷冻，进行卵裂期胚胎移植。排除标准：曾进行降调节预处理、内膜准备过程中有优势卵泡发育、内膜准备过程中存在经皮或阴道内使用雌二醇、解冻失败周期、子宫畸形、合并内外科基础疾病等。

二、研究方法

1.内膜准备：所有患者均采用递增法HRT方案进行内膜准备，研究前有/无进行口服短效避孕药预处理。在月经第2～4天开始口服戊酸雌二醇(补佳乐，拜耳，德国)或17β雌二醇(芬吗通，雅培，美国)4 mg，用药第6～7天加服至6 mg/d。一共用药12～14 d后进行经阴道超声监测，当内膜厚度≥7 mm、血清孕酮(P)<3 nmol/L则进行内膜转化。未达到转化标准者增加雌激素用量，最大雌激素剂量不超过10 mg/d。转化内膜药物为：黄体酮(黄体酮注射液，浙江仙琚)60 mg/d+地屈孕酮(达芙通，雅培，美国)30 mg/d、黄体酮阴道缓释凝胶(雪诺同，默克雪兰诺，英国)90 mg/d+地屈孕酮30 mg/d、黄体酮80 mg/d。

2.激素分析：内膜转化日常规抽血检测LH、E2、P，检查均采用电化学发光法，设备型号为罗氏cobas 8 000(Roche，德国)。批内变异度：LH<1.2%、E2<6.7%、P<5.3%；批间变异度：LH<2.2%、E2<10.6%、P<8.2%。

3.胚胎评分判定：卵裂期胚胎参考Peter标准进行质量评估。

4.妊娠判断：移植后13～15 d进行血HCG判断，如HCG≥50 U/L，则在移植后28 d进行B超检查，如B超可见孕囊，诊断为临床妊娠；否则为非临床妊娠。孕囊生长在正常宫腔外，诊断为异位妊娠；妊娠28周前胎儿丢失则诊断为流产。

5.分组：(1)按不同平均E2水平进行分组：根据样本数据，患者的E2平均值为800.9 pmol/L，中位数为650.7 pmol/L。故将患者分为3组：A组(E2≤550.5 pmol/L，533周期)；B组(550.5 pmol/L1 101 pmol/L，230周期)。(2)按照不同的临床妊娠结局分为：临床妊娠组(683周期)和非临床妊娠组(819周期)。

三、统计学分析

结 果

一、一般资料

本研究入选1 398例患者共1 502周期。A、B、C三组的平均年龄分别为(31.8±3.2)岁、(32.1±3.3)岁和(32.3±3.2)岁，组间差异均无统计学意义(P>0.05)。内膜转化日血清E2水平因分组因素各组间有统计学差异(P<0.05);其余指标，如不孕年限、内膜转化日内膜厚度、IVF周期占比、常规方案占比、移植胚胎数、优质胚胎移植数、优胚移植周期占比、内膜转化日血清LH、P水平等均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

二、不同血清E2水平患者临床结局比较

研究结果表明，A、B、C三组的临床妊娠率分别为48.6%、46.7%、34.3%，其中C组的临床妊娠率低于A组和B组，且差异有统计学意义(P<0.05)，而A组与B组无统计学差异(P>0.05)。三组间的流产率、异位妊娠率均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 不同血清 E2水平患者一般资料及临床结局比较[(-±s)，%]

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05

三、不同临床结局比较

根据不同的临床结局进行分组，结果显示临床妊娠组的年龄小于非临床妊娠组[(31.6±3.4)岁vs.(32.3±3.2)岁]，临床妊娠组的移植胚胎数[(1.97±0.29)vs.(1.91±0.40)]和优胚移植数[(1.17±0.85)vs.(1.05±0.83)]均大于非临床妊娠组，临床妊娠组血清E2水平[(756.1±580.2)pmol/L vs.(838.4±716.3 pmol/L)]低于非临床妊娠组，以上结果均具有统计学差异(P<0.05)。临床妊娠组与非临床妊娠组在不孕年限、内膜转化日内膜厚度、IVF周期占比、常规方案占比、优胚移植周期占比、血清P、血清LH等方面均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2 不同临床结局患者一般资料及移植情况[(-±s)，%]

注：与临床妊娠组比较，*P<0.05

四、妊娠结局与血清E2水平的相关性分析

以非临床妊娠及血清E2作为两个变量绘制ROC曲线(图1)，得出曲线下面积为0.540(P=0.008)。通过ROC曲线计算，得出非临床妊娠周期的血清E2的截断值为1 045.5 pmol/L，灵敏度为20.8%，特异度为86.7%。

图1 血清E2与非临床妊娠的相关性分析

讨 论

HRT周期与排卵周期不同，HRT周期患者的内源性甾体激素分泌不足，其血清E2大部分与外源性雌激素补充相关，因此血清E2能作为一个独立的控制指标。胚胎植入需要适量的雌激素刺激[3-4]。Paria等[5]的实验证明，如胚胎植入前有雌激素分泌，切除卵巢胚胎可正常植入；但在雌激素分泌前切除卵巢，则胚胎不能植入；单纯添加孕酮将不能维持胚胎继续发育，添加外源性雌激素可诱导植入。雌激素作用不足，将使子宫内膜停留在容受前期改变[6-7]。

超生理剂量的雌激素却不利于胚胎着床。超生理剂量的雌激素从蛋白信号分子、基因层面及代谢层面上对子宫内膜的容受性产生不良影响[8-11]，同时也对母胎界面的构建产生负面影响。2015年Patel等[12]在小鼠实验上发现高水平雌激素下凋亡蛋白水平增加，BCL2-α水平降低，诱发早孕期间合体滋养层细胞凋亡。高雌激素水平也会干扰子宫内膜上皮细胞糖原的合成和分泌。综上所述，异常升高的雌激素对子宫内膜容受性产生不良影响。

HRT周期与自然周期不同，没有排卵后的雌激素水平下降，容易引起围植入期血清E2异常升高[13]。因此，HRT周期内膜转化日高水平血清E2可能对胚胎着床产生不良影响。在本中心1 502个HRT-FET周期中，C组的临床妊娠率显著低于A组及B组(P<0.05)。通过表2的数据可以看出，临床妊娠是多个因素共同影响的结果，临床妊娠组和非临床妊娠组在年龄、移植胚胎数、优胚移植数、血清E2水平之间的差异具有统计学意义。其中临床妊娠组的血清E2(756.1±580.2)pmol/L要低于非临床妊娠者的血清E2(838.4±716.3)pmol/L，差异具有统计学意义，提示内膜转化日雌激素过高与临床妊娠率降低相关。从图1的ROC可以看出，血清E2水平升高与非临床妊娠呈正相关，具有统计学差异；曲线下面积为0.54，血清E2的截断值为1 045.5 pmol/L，灵敏度为20.8%，特异度为86.7%，血清E2在该截断值时特异度较高，当血清E2低于该值时可能预示着更高的临床妊娠率。因此我们猜想，内膜转化日血清E2水平的过高，将对妊娠结局产生不利影响。Fritz等[14]的研究也得出类似的研究结果，HRT周期孕酮使用前血清E2高峰水平与继续妊娠率负性相关，当E2在10th百分位数组(135～214 pg/ml)(1 pg/ml=3.67 pmol/L)时的继续妊娠率最高(54.6%)，E2在11th百分位数至90th百分位数组(215～689 pg/ml)时的继续妊娠率为32.9%，E2在91th百分位数组(692～1 713 pg/ml)时的继续妊娠率仅9.1%，三组组间差异具有统计意义；同时该文中ROC曲线提示，当血清E2≥截断值330 pg/ml(1 211 pmol/L)，血清E2升高与非继续妊娠相关，曲线下面积为0.62。我们认为高血清E2水平可能对胚胎着床产生不利影响。2018年姬萌霞等[15]的研究也显示，在HRT-FET周期临床妊娠组的移植前血清E2水平低于非临床妊娠组[(1 186.2±858.2)pmol/L vs.(1 333.3±983.1) pmol/L]。

Remohi等[16]的研究与我们的研究出现不一致的结果。他们根据不同血清E2水平分为5组，分别为<100 pg/ml、100～199 pg/ml、200～299 pg/ml、300～399 pg/m和≥400 pg/ml(1 pg/ml=3.67 pmol/L)，研究提示各组间的妊娠率、流产率均无统计学差异；该研究的HRT周期均经过亮丙瑞林垂体脱敏，脱敏后雌激素的反应性差异可能是结果不一致的原因。Niu等[17]的研究也出现不一致的结果，该研究依据血清E2分为3组(0～25th；25th～75th；75th～100th)，其中3组间的妊娠率分别为32.2%、38.4%、36.3%，结果无统计学差异；该研究纳入周期数为274周期，每组的人数较少可能是引起研究结果差异的因素。国内邓玲等[18]将人群分为两组(E2≤600 pg/ml组和E2>600 pg/ml组)，妊娠率分别为64.4%和57.8%，结果无统计学差异；但该研究中部分人群阴道内应用了17β-雌二醇，可能引起血清E2水平显著升高致选择偏倚，方案不一致可能引起研究结果差异。

综上，在HRT-FET周期中，内膜转化日血清E2>1 101 pmol/L时，与临床妊娠率下降相关。内膜转化日血清E2有望成为预测HRT-FET妊娠结局的重要参考指标，指导临床用药及胚胎移植策略的调整。