张 杰 赖润民 鞠建庆 陈 卓 徐 浩▲

1.北京中医药大学，北京 100029；2.中国中医科学院西苑医院心血管科，北京 100091；3.中国中医科学院西苑医院血液科，北京 100091

左心室射血分数保留心力衰竭（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）占临床诊断心力衰竭患者的22%～73%[1]，其死亡率与射血分数降低心力衰竭（heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF）相似[2]，且目前证据显示尚无降低HFpEF 患者发病率或死亡率的有效方法[3]。中医气血理论认为与HFrEF 阳虚不得温化水饮不同，HFpEF 的病机为气虚血瘀终致水停，治疗应以益气活血为法[4]。课题组前期荟萃分析证实[5]益气活血法有助于改善HFpEF 患者心功能、E/A 比值及6 min 步行距离。芪参益气滴丸由黄芪、丹参、三七、降香组成，是益气活血的代表方药，多项临床试验显示[6-7]芪参益气滴丸治疗HFpEF 具有良好效果。然而，中药复方化学成分复杂、作用机制多样，芪参益气滴丸治疗HFpEF 的物质基础和作用机制尚不清晰。因此，利用网络药理学方法阐释芪参益气滴丸治疗HFpEF 的潜在活性成分和作用机制，对于开展深入的基础研究和拓展临床思路均具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 芪参益气滴丸活性成分与潜在靶点筛选

利用BATMAN-TCM 平台（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）筛选黄芪、丹参、三七和降香的活性成分及潜在靶点基因。检索参数设置为Score cutoff≥20，P-value cutoff＜0.05，建立活性成分-靶点基因数据库。

1.2 射血分数保留心力衰竭的疾病靶点筛选

利用GeneCards（http：//www.genecards.org/）和PALM-IST 平台（http：//www.hpppi.iicb.res.in/ctm/）筛选HFpEF 的疾病靶点基因，以“heart failure with preserved ejection fraction”为关键词进行检索。

1.3 “药物-活性成分-作用靶点”网络构建与分析

利用Cytoscape 3.2.1 软件构建“药物-活性成分-作用靶点”网络并进行可视化，利用network analyzer插件进行网络拓扑结构分析，将自由度≥10 的靶基因导入STRING 数据库（https：//string-db.org/）进行基因相互作用分析。

1.4 基因富集分析

将芪参益气滴丸治疗HFpEF 的靶基因导入Metascape数据库（http：//metascape.org）进行基因富集分析。以P ＜0.01 为差异有统计学意义的筛选条件，设置min overlap=3，min enrichment=1.5，对获取的靶点进行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析及可视化。

2 结果

2.1 芪参益气滴丸治疗HFpEF 的活性成分和潜在靶点

经BATMAN-TCM 平台检索，共获得芪参益气滴丸化学成分112 个，经GeneCards 和PALM-IST 平台检索，共获得人类HFpEF 疾病靶点基因804 个，取芪参益气滴丸靶点基因和HFpEF 疾病靶点基因交集，共获得芪参益气滴丸治疗HFpEF 的潜在靶点基因262 个，具有治疗HFpEF 作用的活性成分95 个，其中靶基因数目在20 以上的主要活性成分26 个。见表1。

表1 芪参益气滴丸治疗射血分数保留心衰的主要活性成分

2.2 “药物-活性成分-作用靶点”网络及靶点互作分析结果

利用Cytoscape 3.2.1 构建芪参益气滴丸治疗HFpEF 的“药物-活性成分-作用靶点”网络图，该网络图共包含361 个节点（4 个药物，95 个成分靶点，262 个基因靶点），1362 条边，深绿色六边形节点代表药物，浅绿色矩形节点代表活性成分，黄色圆形节点代表作用靶点。见图1（封四）。用network analyzer 插件进行网络拓扑结构分析，自由度≥10 的39 个重要靶点基因相互作用关系。见图2。

2.3 GO 富集分析

图2 自由度≥10 的39 个重要靶点基因相互作用网络图

GO 富集分析结果显示，芪参益气滴丸治疗HFpEF的生物学过程主要包括血液循环、循环系统过程、系统过程的调控、循环系统的血管过程、血管口径的调节等；细胞成分主要包括膜筏、膜微区、膜区等；分子功能主要包括受体-配体活性、受体调节活性、细胞因子活性等，涉及细胞信号转导、免疫反应等。见图3（封四）。

2.4 信号通路富集分析

KEGG 信号通路富集靶点数量前20 的信号通路涉及氧化应激、炎性反应、心肌纤维化和细胞凋亡等与HFpEF 密切相关的病理生理学过程。见图4（封四）。

3 讨论

HFpEF 是一种复杂的临床综合征，其病理生理学机制尚不明确，涉及全身微血管炎症、氧化应激、心肌纤维化、上皮功能受损、神经激素激活和心室-动脉耦合等多个病理环节[8-9]。HFpEF 目前尚无理想的药物治疗方法，如何早期干预HFpEF 成为临床亟待解决的难题。中医学理论认为气虚血瘀是HFpEF 的关键病机，益气活血作用的中医药具有较好的缓解HFpEF 患者症状和改善心脏舒张功能的作用，展现出良好的临床应用价值。

芪参益气滴丸是益气活血的代表方药，既往研究显示芪参益气滴丸具有抗炎[10]、抗心肌细胞凋亡、延缓心室重构等作用[11-14]。本研究亦发现芪参益气滴丸中黄芪、丹参、三七的20 余种主要活性成分可通过调控多个基因发挥治疗作用。如丹参的有效成分丹参新酮具有抗氧化应激的作用，其诱导的核因子Nrf2 和血红素加氧酶-1 表达与MAPK 途径有关，通过HO-1和MAPK/Nrf2 依赖途径保护人EA.hy926 内皮细胞免受氧化低密度脂蛋白衍生的氧化应激损伤[15]；黄芪的有效成分刀豆氨酸是诱导型一氧化氮合酶的选择性抑制剂[16]，具有抑制炎性反应和氧化应激的作用。

GO 生物学过程富集分析结果显示芪参益气滴丸可通过调节循环系统、神经调节、氧化应激、免疫应答、激素调节等多个生物过程发挥治疗HFpEF 的作用，这与HFpEF 发病机制复杂、涉及多个病理环节的疾病特点相吻合[3,8]。

KEGG 富集分析结果显示芪参益气滴丸治疗HFpEF 相关通路涉及炎性反应、氧化应激、心肌纤维化、细胞凋亡等多种病理生理学过程。炎症在HFpEF的发病中扮演着重要角色[17]，Paulus 等[18]提出HFpEF发病机制的新理论，即合并症诱导全身性炎症状态、冠状动脉微血管内皮炎症、cGMP 含量和蛋白激酶G（protein kinase G，PKG）活性降低，导致心肌顺应性降低、心室肥大，将对HFpEF 病理机制的认识从左心室后负荷转移到冠状动脉微血管炎症。推测芪参益气滴丸既可作用于TNF 信号通路、IL-17 信号通路等炎症相关途径直接抑制炎性反应，又能作用于MAPK 信号通路等氧化应激途径间接抑制炎性反应；此外，氧供需失衡在CHF 中普遍存在，HIF-1α 在组织对缺氧的反应中发挥关键作用，能够调节心肌细胞氧供平衡，降低炎性反应，减轻心肌纤维化[19]。HFpEF 的发病与高血压、糖尿病、高胆固醇血症等密切相关[20-21]，上述合并症可导致全身炎性反应及血管内皮细胞氧化应激[16]，大约45%的HFpEF 患者有糖尿病[22]，芪参益气滴丸可作用于糖尿病中的AGE-RAGE 信号通路，降低高糖环境所致的氧化应激和炎性反应。同时，芪参益气滴丸通过钙信号通路、cGMP-PKG 信号通路等改善心肌顺应性及僵硬度，减轻心肌重构。cGMP-PKG信号通路是HFpEF 机制的研究热点，cGMP 信号传导与心肌舒张功能障碍和心室重构有关：促炎状态下，血浆中IL-6、TNF-α、可溶性ST2 和五聚蛋白3 升高，冠状微血管内皮细胞反应性产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）、血管细胞黏附分子（vascular cell adhesion molecules，VCAMs）和E-选择蛋白，ROS 的产生导致一氧化氮生物利用度降低，可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）和PKG活性降低，低PKG 活性增加了心肌细胞的静息张力；内皮细胞中的VCAM 和E-选择蛋白表达迁移到单核细胞内皮下，释放转化生长因子β，刺激成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，使心肌顺应性降低，舒张功能障碍[23]。此外，芪参益气滴丸通过TNF 信号通路等抑制细胞凋亡，亦是其治疗HFpEF 的重要机制之一。

综上所述，本研究应用网络药理学方法对芪参益气滴丸治疗HFpEF 的活性成分、作用靶点和信号通路进行了探索性研究，初步发现芪参益气滴丸中的主要活性成分可通过调控炎性反应和氧化应激、改善心肌顺应性和调控细胞凋亡等途径发挥治疗HFpEF 的作用，具有多成分、多靶点、多途径整合调节的效应特点，为进一步深入开展芪参益气滴丸治疗HFpEF 的作用机制研究提供了新的思路和线索。