高晓斌 武雪亮 赵轶峰 聂双发 梁 峰 刘小飞 窦金山 张迎春

1.河北北方学院附属第一医院普通外科，河北张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院小儿外科，河北张家口 075000；3.河北北方学院研究生学院，河北张家口 075000

据最新流行病学调查显示，2014 年我国居民结直肠癌发病例数位居第五，严重威胁国民健康[1]。结直肠癌的早期诊断、规范化治疗和预后监测，对患者生存时间、生活质量有着重要影响。从分子生物学水平，寻找精准度高、特异性强的标志物已成为结直肠癌诊疗领域的研究热点，同时为肿瘤的靶向治疗提供新的技术支撑[2-4]。

DNA 甲基转移酶（DNMTs）是人类表观遗传学中催化并维持DNA 基化结构和功能的重要酶家族[5]。DNMTs包含3个重要成员：DNMT1、DNMT2 和DNMT3，其中DNMT1 是目前研究最为广泛也最为深入的酶类，其在DNA 修复和正常甲基化功能过程中发挥关键作用；DNMT2 主要负责tDNA 的甲基转移，DNMT3 内含3 个亚基，3a、3b 和3L，3a、3b 与启动子区CpG 岛、DNA 的异常甲基化关系密切，而3L 系调节蛋白[6]。研究证实，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 的活性增强或表达上调能介导DNA 异常甲基化，与人类诸多肿瘤的发生、发展密切相关[7-10]，但在结直肠癌中的研究较少。本研究通过对结直肠癌和正常组织中DNMT1、DNMT3a 行实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）和免疫组织化学检测分析，旨在探讨二者在结直肠癌中的表达情况及与相关临床病理因素间的关系，为结直肠癌的早期诊断和预后监测提供可靠的分子生物学标志物，为结直肠癌的靶向诊疗提供科学参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

共纳入2017 年2 月～2018 年2 月河北北方学院附属第一医院（以下简称“我院”）普通外科手术切除并经病理确诊的结直肠癌组织（癌组）和癌旁正常组织（正常组）标本，各50 例，同时收集患者完整的临床资料。本研究经我院医学伦理委员会审核批准。

1.2 主要试剂和仪器

RNA 逆转录试剂购自日本Takara 公司；PCR 试剂盒、PrimeScriptTMRT reagent 试剂盒购自日本Takara公司；DNMT1、DNMT3a 和β-actin 引物由生工生物（北京）有限公司设计合成；全自动电化学发光免疫分析仪购自瑞士罗氏公司E2010；DEPC 水购自美国Sigma 公司；兔抗人DNMT1 单克隆抗体、兔抗人DNMT3a 多克隆抗体均购自美国Santa Cruz 公司；DAB显色试剂盒购自北京中杉公司。

1.3 实验方法

1.3.1 qRT-PCR 按TRIzol RNA 试剂盒说明书提取总RNA，用PrimeScriptTMRT reagent 试剂盒逆转录合成cDNA 2 μL 逆转录产物进行PCR 扩增，PCR 扩增引物如下，DNMT1 正向引物：5′-CGATGAGGAAGTCGATGATAACAT-3′，反向引物：5′-ATGCGATTCTTGTTCTGTTTCTTCT-3′；DNMT3a 正向引物：5′-GCCCAAGGTCAAGGAGATTATTG-3′，反向引物：5′-TCTGCCGCACCTCGTACAC-3′；β-actin 作为内参，正向引物：5′-AGGAAGCTTCCAGACACGC-3′，反向引物：5′-CGCACTGCCATTTTAGCTCC-3′。PCR 反应条件：95℃变性10 min，进行40 个循环：95℃变性15 s，60℃退火2 s，72℃延伸40 s，然后根据SYBRGreen 染色法行相对定量分析，荧光定量PCR 实验数据处理使用2-△△Ct法。

1.3.2 免疫组织化学法 将癌组织标本连续切片4 μL贴附于经多聚赖氨酸处理的玻片上，80℃烘烤50 min，光镜下观察切片中DNMT1、DNMT3a 蛋白的表达和分布情况，每张切片选取5 个高倍视野（400×）。DNMT1 蛋白阳性主要分布于细胞核中，而DNMT3a蛋白阳性主要分布于细胞质和细胞膜中，均呈棕黄色颗粒。判断标准：按染色强度，无着色为0 分，淡黄为1 分，深黄2 分，棕褐或棕黄3 分；阳性细胞计数，＜10%为0 分，10%～＜25%为1 分，25%～＜50%为2 分，50%～＜75%为3 分，≥75%为4 分。两者相加＜2 分为阴性（-），2～3 分为弱阳性（+），4～5 分为中等强度阳性（++），6～7 分为强阳性（+++），由两名具备高级职称的病理医师经双盲法独立评分。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，采用t 检验，计数资料以百分率表示，采用χ2检验。相关性分析应用Spearman检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌和癌旁正常组织中DNMT1 mRNA、DNMT3a mRNA 表达

以目标基因与β-catenin 的比值作为qRT-PCR定量分析结果，癌组中DNMT1 mRNA 的表达水平（0.36±0.07）明显高于正常组（0.09±0.01），差异有统计学意义（t=10.951，P=0.000）；癌组中DNMT3a mRNA 的表达水平（0.33±0.06）明显高于正常组（0.11±0.02），差异有统计学意义（t=8.724，P=0.000）。

2.2 结直肠癌和癌旁正常组织中DNMT1 和DNMT3a 蛋白的表达

免疫组化结果显示，癌组中DNMT1 蛋白阳性表达为84.00%（42/50），明显高于其在正常组中的表达[24.00%（12/50）]，差异有统计学意义（χ2=21.545，P=0.000）；癌组中DNMT3a 蛋白阳性表达为78.00%（39/50），明显高于其在正常组中的表达[30.00%（15/50）]，差异有统计学意义（χ2=18.433，P=0.000）。见图1。

图1 DNMT1、DNMT3a 在结直肠正常组织和癌组织中的表达（SP，200×）

2.3 DNMT1 和DNMT3a 蛋白表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系

DNMT1 和DNMT3a 蛋白表达均与肿瘤的浸润深度、TNM 分期、淋巴结转移及肝转移相关（均P ＜0.05）。TNM 分期越高，二者的表达水平越高（均P ＜0.05），伴淋巴结转移、肝转移的患者二者的表达水平明显高于未转移的患者（均P ＜0.05），而二者的表达水平与患者肿瘤大小、分化程度均无相关性（均P ＞0.05）。见表1。

表1 DNMT1 和DNMT3a 蛋白表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系[例（%）]

2.4 结直肠癌组织中DNMT1 和DNMT3a 蛋白表达的相关性

DNMT1 和DNMT3a 蛋白表达呈正相关（r=0.455，P=0.000）。见图2。

图2 结直肠癌组织中DNMT1 和DNMT3a 蛋白的相关性

3 讨论

结直肠癌的发生、发展是多个基因调控的多步骤、多阶段的复杂病变过程，其中抑癌基因的失活和致癌基因的激活发挥关键作用，其病变机制涉及表观遗传学的改变，包括DNA 甲基化、染色体重塑、组蛋白修饰和lncRNA 调控[11-14]，其中DNA 甲基化是目前研究最为深入的机制。

DNMT1 是由Bestor 等[15]于1988 年在真核生物中克隆出胞嘧啶特异DNA 转移酶，即DNMT1。DNMT1 定位于人染色体19p13.2～19p13.3，内含1616 个氨基酸残基，相对分子量为183×103，包括3 个结构域，即N 端的某些特定蛋白识别靶区域、C 端的催化端和相对的未知区域[16-17]。DNMT1 主要介导甲基化模式的建立与维护，而DNMT3a 主要负责从头甲基化，二者高表达可以诱导甲基化模式异常、致癌基因激活和抑癌基因沉默，从而导致肿瘤发生。

研究发现DNMT1 在人类诸多肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。DNMT1 是DNA 甲基化的关键作用酶，其活性的增加能促进DNA 异常甲基化。Li 等[18]通过对胰腺癌组织和相应正常组织行免疫印迹和免疫组化法检测，发现约80%、78.7%的癌组织中DNMT1呈高表达状态，表明DNMT1 的异常高表达与胰腺癌的发生密切相关。Yang 等[19]应用采用免疫组织化学法检测54 例胃癌患者石蜡切片中DNMT1 和DNMT3a的表达，发现DNMT1、DNMT3a 在胃癌组织中的过表达分别为54 例（64.8%）、38 例（70.4%），且二者与TNM 分期和淋巴结转移显著相关。冯悦静等[20]应用酶联免疫吸附试验法检测136 例肺癌患者和147 名健康对照者中DNMT1 和DNMT3a 的蛋白表达，发现二者蛋白表达水平均显著高于正常对照组，进一步logistic 回归结果证实，二者蛋白的高表达能增加肺癌的发病率。

本研究显示DNMT1 和DNMT3a 在结直肠癌组织中表达明显高于正常组，表明在肠黏膜癌变的过程中，细胞核中的DNMT1 和细胞质、细胞膜上的DN MT3a 水平逐步上调，启动DNA 异常甲基化过程，相应的调控基因表达受抑制，从而导致肿瘤的发生；进一步研究显示，DNMT1 和DNMT3a 表达水平与结直肠癌的浸润深度、TNM 分期、淋巴结和肝转移均明显相关，且二者表达呈明显正相关，提示DNMT1 和DNMT3a的表达与结直肠癌的临床病理参数相关，二者共同参与建立、维持整个DNA 甲基化模式的过程，二者表达越高，病变越严重、预后越差。DNMT1 和DNMT3a同时作用的甲基化酶效应是各自单独作用的近5 倍，DNMT3a 介导从头甲基化的启动后，半甲基化DNA底物激活DNMT1 活性使之完成后续的甲基化修饰；而DNMT1 能够催化未修饰的DNA 发生甲基化，DNMT3a 的从头甲基化活性则是通过甲基化的DNA 与DNMT1 酶位于N 端的变构位点的靶向结合而被激活的。

综上，DNMT1 和DNMT3a 的异常表达对结直肠癌的发生和进展有重要作用。本研究仅从基因和蛋白水平分析二者在结直肠癌组织中的表达情况，其具体的异常甲基化作用机制及相关通路的研究尚不明确，这也是笔者下一步的研究方向。