李 欣 李 芳 王 媛 张宝玉 张丽洁

1.首都医科大学附属北京潞河医院内分泌代谢与免疫性疾病中心，北京 101149；2.山西医科大学第二医院风湿免疫科，山西太原 030001

类风湿关节炎（RA）具有较高的致残率，目前尚无有效方法逆转或修复软骨与骨的破坏。破骨细胞在维持骨吸收和骨形成的过程中起着重要的作用[1]。NF-κB 受体活化因子配体（RANKL）是调节破骨细胞生成的关键因子，其介导的NF-κB 信号通路对诱导破骨细胞生成、活化，抑制破骨细胞凋亡有着重要的作用[2-3]。研究发现，RANKL 介导的NF-κB 信号通路的激活与肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）、c-fos、活化T 细胞核因子1（NFATc1）等物质有关[4-5]。苦参碱具有免疫抑制作用[6]，其可能与NF-κB 信号通路有关。本研究将通过体外实验，探索苦参碱对RANKL 诱导破骨细胞分化及c-fos、TRAF6、NFATc1 表达的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

RAW264.7 细胞（湖南丰晖生物科技有限公司，CL0266）培养于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素的DMEM 培养基（北京索莱宝生物技术有限公司，12100）中，在恒温培养箱中以5% CO2、37℃及饱和湿度条件下培养。

1.2 分组

根据加入破骨细胞诱导剂RANKL（北京索莱宝生物技术有限公司，P00226-50 μg）及不同剂量苦参碱（北京索莱宝生物技术有限公司，SM8130-20 mg）分为五组，即空白组（A 组）、诱导组（B 组）、苦参碱低剂量组（0.5 mg/mL，C 组）、苦参碱中剂量组（1 mg/mL，D 组）、苦参碱高剂量组（2 mg/mL，E 组）。

1.3 TRAP 染色

RAW264.7 细胞培养24 h 后，3000 r/min，半径10 cm，离心3 min，弃上清，取细胞悬液300 μL 在6 孔板上爬片，诱导、给药，7 d 后TRAP 染色（北京索莱宝生物技术有限公司，G1492），显微镜观察多核破骨细胞。

1.4 甲苯胺蓝染色

诱导给药12 d 后，每孔加入1 mL 甲苯胺蓝染色液（北京索莱宝生物技术有限公司，G3660）染色，水洗，晾干，显微镜观察骨吸收陷窝。

1.5 qPCR

诱导给药48 h 及9 d 后分别检测TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 及Calcr、Ctsk mRNA 的表达量。方法：各组中加入1 mL Trizol（北京全式金生物技术有限公司，H10318）提取总RNA，反转录为cDNA 后，用Real-time PCR 试剂盒（北京全式金生物技术有限公司，AQ131-01）扩增目的基因，上海晶莱生物技术有限公司合成引物（Calcr F 5′-GAAGTGCCCGCTGATGCCT-3′，R 5′-TGGCTCTCCTGACTTGGTGTT-3′；Ctsk F 5′-CACCCTTAGTCTTCCGCTCA-3′，R 5′-CTTGAACACCCACATCCTGCT-3′；TRAF6 F 5′-CAGCGTGTACGATCGGGTT-3′，R 5′-AAGACCCAAGTTTCCGTGCC-3′；c-fos F 5′-GGCAGAAGGGGCAAAGTAGA-3′，R 5′-GTTGATCTGTCTCCGCTTGG-3′；NFATc1 F 5′-CGTACCTTCCTGCCAATGGT-3′，R 5′-GGGCTATCACGTGGTGTGAA-3′），经95℃5 min 预变性，95℃15 s变性、60℃1 min 退火，共40 个循环，后以95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s，导出熔解曲线，计算Ct 值，GAPDH 为管家基因，用2-ΔΔct法算出Calcr、Ctsk、TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 表达量。

1.6 Western blot

诱导给药48 h 后，各组中加入蛋白提取液获得样品，行SDS-PAGE 凝胶电泳、上样，转膜后封闭，TRAF6、c-fos、NFATc1 一抗孵育，清洗，二抗孵育，清洗，ECL 显色曝光后进行图像处理，进行TRAF6、cfos、NFATc1 蛋白定量。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用One-Way ANOVA分析，进一步两两比较采用Tukey 检验。以P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TRAP 染色

RANKL 诱导后，镜下可见大量多核破骨细胞，苦参碱干预后，镜下多核破骨细胞较B 组减少，以D 组、E 组效果为著。见图1。

图1 各组甲基绿染色情况（400×）

2.2 Calcr 和Ctsk mRNA 表达量

与A 组比较，B 组Calcr、Ctsk mRNA 表达量明显增加（P <0.01）。与B 组比较，C、D、E 组Calcr 和Ctsk mRNA 表达量减少（P<0.05）。C、D、E 组Calcr 和Ctsk mRNA 表达量两两比较差异有统计学意义（P <0.05），且随苦参碱浓度增加，Calcr 和Ctsk mRNA 表达量呈逐渐降低趋势，呈剂量依赖性。见图2。

2.3 甲苯胺蓝染色

B 组骨吸收陷窝较A 组增加。与B 组比较，E 组骨吸收陷窝明显减少。见图3。

2.4 TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 表达量

图2 各组Calcr 和Ctsk mRNA 表达量比较

图3 各组甲苯胺蓝染色（400×）

与A 组比较，B 组TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA表达量明显升高（P <0.01）。与B 组比较，C、D、E 组TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 表达量明显下降（P <0.01），且呈剂量依赖性。C、D、E 组TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 表达量两两比较差异有统计学意义（P<0.05）。A 组和E 组TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA表达量比较差异无统计学意义（P >0.05）。见图4。

2.5 TRAF6、c-fos、NFATc1 蛋白表达

与A 组比较，B 组TRAF6、c-fos、NFATc1 蛋白表达量明显增多。与B 组比较，C、D、E 组TRAF6、cfos、NFATc1 蛋白表达量均下降，且呈剂量依赖性。A 组与E 组TRAF6、c-fos、NFATc1 蛋白表达量比较无明显差异。见图5。

图4 各组TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 表达量比较

3 讨论

RA 是一类具有较高致残率的自身免疫性疾病，骨量减少与骨质破坏是RA 致残的主要原因。而破骨细胞是人体内唯一具有骨质破坏能力的细胞[1]。近年来破骨细胞活化机制的研究已成为热点[7]。RANKL 分泌增加则是破骨细胞分化的必要条件[8]。而RANKL介导的NF-κB 信号通路对破骨细胞分化至关重要。RANKL 可与RANK 结合，使其与下游TRAF6 结合，活化NF-κB，促进c-fos 基因表达，c-fos 则可进一步与NFATc1 结合并相互作用，诱导破骨细胞分化[9-10]。

图5 各组TRAF6、c-fos、NFATc1 蛋白表达

苦参是一种天然中草药，可用于治疗感染、恶性肿瘤等疾病[11]。苦参碱作为其主要成分之一，具有免疫抑制作用[12-13]。研究发现，苦参碱可通过降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等促炎因子减轻关节炎鼠关节肿胀度，降低关节炎指数[14]。此外，苦参碱衍生物M19 也被人证实具有相同的作用[15]。

近年苦参碱对破骨细胞作用机制的研究逐渐增多，发现其可抑制TLR4 和c-Jun 表达，选择性下调脂多糖诱导体外破骨细胞TNF-α 和IL-1β 的表达[16]。Chen 等[17]发现，苦参碱可降低血清中前炎性因子TRAcp5b、TNF-α 和IL-6 的水平，抑制NF-κB 等多条信号通路，进而抑制破骨细胞分化。同期研究发现，苦参碱可调节Th1、Th2 反应不平衡状态，考虑可能与NF-κB 信号通路作用于T 细胞有关[18]。

此外，M19 可在体外抑制MAPKs 磷酸化及NFκB 活性，诱导RA-FLS 凋亡，抑制促炎细胞因子及MMP-1、MMP-3、MMP-13 的表达[15]。同时Chen 等[19]发现，核糖体蛋白S5（RPS5）与M19 可协同抑制破骨细胞形成。而苦参碱的另一种衍生物——M54 也可靶向作用于RPS5，抑制破骨细胞生成[20]。研究发现苦参碱可作用于RANKL 介导的NF-κB 信号通路，但对该通路中所涉及的TRAF6、c-fos、NFATc1 相关分子的研究甚少。因此，本实验初步探究了苦参碱对RANKL诱导破骨细胞分化及TRAF6、c-fos、NFATc1 表达的影响。

本实验诱导组镜下可见大量多核破骨细胞、骨吸收陷窝，且Calcr、Ctsk mRNA 表达量较空白组明显升高，考虑破骨细胞诱导成功。随苦参碱浓度增加，多核破骨细胞数量、骨吸收陷窝及Calcr、Ctsk mRNA 表达量呈逐渐下降趋势，且呈剂量依赖性。此结果同Chen等[17]报道结果一致。此外，诱导组中TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 及蛋白的表达量最高，提示破骨细胞活化与TRAF6、c-fos、NFATc1 分子有关。而随苦参碱浓度的增加，TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 及蛋白的表达量呈逐渐下降趋势，考虑可能的机制：苦参碱抑制TRAF6 表达，干扰其与RANK 结合，抑制NF-κB活化、c-fos、NFATc1 表达，最终致破骨细胞活化障碍。该结果为苦参碱抑制破骨细胞分化相关机制研究提供了一定的理论基础，但苦参碱对破骨细胞抑制作用的最佳药物浓度仍有待进一步验证。