焦资君,金介员,项 荣

(中南大学生命科学学院,中国湖南 长沙 410013)

黏脂贮积症Ⅱ型(mucolipidosis typeⅡ,MLⅡ或I-cell disease;OMIM 252500)是一种罕见的常染色体隐性遗传病,其发生率为1/125 000～1/625 000[1]。值得注意的是,在加拿大Quebec(魁北克)地区黏脂贮积症Ⅱ型携带者频率竟有1∶39之高,其新生儿发病率高达1∶6 000[2]。黏脂贮积症Ⅱ型是由GNPTAB基因纯合突变或复合杂合突变导致N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶(N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase)的功能完全丧失而引发的溶酶体储存障碍疾病[3]。GNPTAB基因的编码产物是N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶的主要部分,大部分溶酶体酶需要在N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶的作用下合成甘露糖-6-磷酸(mannose-6-phosophate,M6P)分选信号,M6P的作用是将各种溶酶体酶靶向运输到溶酶体。黏脂贮积症Ⅱ型患者细胞内的溶酶体酶因缺少M6P分选信号,导致溶酶体酶分选错误并大量被分泌到细胞外环境,这将对患者的细胞、组织、器官乃至系统产生广泛的影响。

1 黏脂贮积症Ⅱ型的表型与诊断

黏脂贮积症Ⅱ型患者在产前和新生儿时期就会发病且大多数生命不超过10岁,严重者出生后几个月就会死亡。患者出生时的身高和体重均低于正常人,在2岁后身高停止增加,最终身高小于80 cm[3]。黏脂贮积症Ⅱ型的典型表型包括[4～5]:1)骨骼异常,比如颅缝早闭、骨质减少、佝偻病、胸廓畸形、脊柱后凸、髋关节发育不良、畸形足、软骨发育不良、所有大关节挛缩等;2)严重的精神运动迟缓;3)皮肤增厚、面部粗糙、牙龈肥大;4)心脏肥大,二尖瓣功能不全;5)气道变窄,呼吸功能不全;6)复发性肺炎;7)肝脾肿大。

GNPTAB突变可以导致黏脂贮积症Ⅱ型或黏脂贮积症Ⅲ α/β 型(mucolipidosis type Ⅲ α/β,MLⅢα/β,OMIM 252600)。黏脂贮积症Ⅱ型与黏脂贮积症Ⅲα/β型患者有许多共同的生理特征[6],如面部粗糙、身材矮小、渐进性关节僵硬、骨骼异常、心脏肥大和发育迟缓等,但黏脂贮积症Ⅱ型比黏脂贮积症Ⅲα/β型更严重,黏脂贮积症Ⅱ型患者在婴儿期或儿童早期就会发病且大多数生命不超过10岁。黏脂贮积症Ⅲα/β型的发生率为1/53 000～1/1 250 000[1],表型相对温和,临床症状出现较晚,大约在3岁或者更晚出现,进展较慢,病程较长,大多可以存活到成年。黏脂贮积症Ⅱ型与黏脂贮积症Ⅲα/β型之所以有上述差异,主要原因是GNPTAB突变类型不同,从而使其产物N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶的活性受到的影响程度也就不同。当GNPTAB发生纯合或复合杂合的移码或无义突变时,N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶的活性几乎完全丧失,患者则表现出症状严重的黏脂贮积症Ⅱ型;当GNPTAB发生错义或剪接位点突变时,N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶会保留部分活性,患者则表现出症状相对较轻的黏脂贮积症Ⅲ α/β 型[7]。Wang等[6]报道,GNPTAB基因c.1090C＞T(p.R364*)的纯合突变导致黏脂贮积症Ⅱ型,而GNPTAB基因的复合杂合突变c.1090C＞T+c.2715+1G＞A(p.R364*+IVS13+1G＞A)则导致黏脂贮积症Ⅲα/β型,后者的N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶由于保留了部分活性而使疾病症状相对较轻。此外,极少量GNPTAB基因突变患者中会出现中间型的mucolipidosis(intermediate ML),它是介于黏脂贮积症Ⅱ型和黏脂贮积症Ⅲα/β型之间的一种表型。Intermediate ML的临床症状为身材矮小、面部粗糙、所有关节活动受限、手短而宽等,其严重程度与黏脂贮积症Ⅱ型相似或略轻,比黏脂贮积症 Ⅲ α/β型严重,但该类患者的寿命远远高于黏脂贮积症Ⅱ型,与黏脂贮积症Ⅲ α/β型相似。

黏脂贮积症Ⅱ型的诊断需从表型、酶活性及基因突变几个方面进行综合考虑。在黏脂贮积症Ⅱ型患者血浆中部分溶酶体水解酶活性呈高水平状态,如β半乳糖苷酶、α半乳糖苷酶、α葡糖苷酶、β氨基己糖苷酶、α甘露糖苷酶、β甘露糖苷酶、β葡萄糖醛酸酶等,这些溶酶体水解酶活性可达到正常范围的10～60倍甚至更高[7～8]。Wang等[6]检测了30例黏脂贮积症Ⅱ型患者和8例黏脂贮积症Ⅲα/β型患者血浆α甘露糖苷酶的活性,结果显示该酶活性都呈高水平状态,但在两类患者之间无显著差异。黏脂贮积症Ⅱ型和黏脂贮积症Ⅲα/β型可通过临床诊断进行区分[9],黏脂贮积症Ⅱ型患者病症出现早,一般几个月或几岁就有明显严重症状,如严重发育迟缓、全身张力减退、牙龈增生、身材矮小、五官粗糙、骨骼畸形等;黏脂贮积症Ⅲα/β型患者虽然与黏脂贮积症Ⅱ型患者有许多相似症状,如身材矮小、骨骼异常、发育迟缓等,但症状相对温和,且出现较晚、进展较慢、病程较长,可以存活到成年。黏多糖贮积症(mucopolysaccharidosis)虽具有与黏脂贮积症Ⅱ型相似的临床特征,但二者可通过尿检结果比较葡糖氨基葡聚糖进行区分:在黏多糖贮积症患者中葡糖氨基葡聚糖有明显增加,葡糖氨基葡聚糖的尿检结果是阳性,而在黏脂贮积症Ⅱ型患者中葡糖氨基葡聚糖的水平是正常的,葡糖氨基葡聚糖的尿检结果是阴性[10]。另外,从GNPTAB基因测序结果看,GNPTAB基因双等位基因致病变异将辅助黏脂贮积症Ⅱ型患者的临床诊断[7]。

2 黏脂贮积症Ⅱ型的发生机制

2.1 M6P标记的形成与溶酶体酶的定向运输

溶酶体在细胞内主要起消化作用,清除无用的生物大分子、衰老的细胞器和衰老损伤及死亡的细胞等[11]。溶酶体的功能是由其包含的多种不同酸性水解酶所完成的,这些溶酶体酶包括糖苷酶、硫酸脂酶、磷酸酶、脂肪酶、磷脂酶、蛋白酶和核酸酶等[11],大多数溶酶体酶是通过M6P分选信号靶向运输到溶酶体行使功能[12]。

M6P标记分两步合成[12],此过程需要两种酶参与:N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶和磷酸葡糖苷酶。第一步,N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶与被识别的溶酶体水解酶和单糖二核苷酸结合,将单糖二核苷酸上磷酸化的N-乙酰氨基葡萄糖转移到溶酶体水解酶高甘露糖寡糖链上的甘露糖残基上;第二步,磷酸葡糖苷酶除去连接在溶酶体水解酶末端的N-乙酰氨基葡萄糖,暴露出磷酸基团,从而形成M6P标记。溶酶体酶在粗面内质网上合成后经过加工、修饰形成N-连接的甘露糖蛋白,然后内质网以出芽的方式将它转运到高尔基体,在高尔基体顺面膜囊中寡糖链上的甘露糖残基被磷酸化形成M6P标记,带有M6P标记的酶与高尔基体反面膜囊上的M6P受体结合并经网格蛋白包被膜泡运输到溶酶体中。

有M6P标记的溶酶体酶能靶向运输到溶酶体行使正常功能,而GNPTAB基因突变导致N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶功能丧失,使溶酶体酶磷酸化和定位异常,从而不能正常形成M6P标记,最终溶酶体酶的靶向运输受阻并引起细胞内溶酶体功能异常[13]。

2.2 GNPTAB基因突变导致黏脂贮积症Ⅱ型

N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶是相对分子质量为540 kD的异六聚体复合物,由α、β、γ 3种不同亚基按2∶2∶2的比例组成[14]。其中,α和β亚基由GNPTAB基因编码,γ亚基由GNPTG基因编码。人GNPTAB基因位于染色体12q23.3,含21个外显子[7]。GNPTAB基因经过转录和翻译后在高尔基体膜上形成由1 256个氨基酸组成的无活性αβ前体蛋白,随后S1P(site-1 protease)蛋白酶将αβ前体蛋白从第928位的赖氨酸和第929位的天冬氨酸之间断裂,形成α、β两部分,参与六聚体的组装[14～15]。

GNPTAB基因编码的N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶的α/β亚基包含三类可识别的结构域(Stealth、Notch和 DMAP)[16]:4个 Stealth结构域,其氨基酸位置分别位于75～86位、322～438位、955～1 020位、1 149～1 185位;两个Notch结构域,分别位于438～468位、505～535位;1个 DMAP相互作用结构域,位于第694～819位。Stealth结构域类似于在细菌中发现的能调解细胞壁多糖合成的因子,是N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶的催化功能结构域;Notch结构域属于Notch受体家族,它们能诱导与之结合的蛋白质裂解;DMAP相互作用结构域能与水解酶结合[16]。目前已有200多个GNPTAB基因突变被报道[17]。GNPTG基因编码的γ亚基是一个由305个氨基酸组成的可溶性糖蛋白,能增强部分溶酶体酸性水解酶底物的磷酸化作用[18]。

Qian等[16]构建了GNPTAB基因31个已知的错义突变的点突变细胞系,这些突变位点分布在Stealth、Notch、DMAP结构域。在Stealth结构域的错义突变分析实验中,大部分Stealth结构域的错义突变使N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶滞留在内质网,另有6个Stealth结构域错义突变的N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶能够到达高尔基体,但是也没有催化功能。这说明Stealth结构域在N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶中行使催化功能。同时,他们还证实Notch和DMAP结构域的突变并不影响N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶的催化功能,但是Notch和DMAP结构域突变后N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶对其底物的选择性识别能力却明显减弱。以上结果表明在N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶中α、β亚基能特异性识别底物并起催化作用。

针对N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶结构域的功能分析[16]显示,GNPTAB基因突变将从以下几个方面影响N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶的功能:1)导致错误折叠,使αβ前体蛋白从内质网中输出受阻;2)改变N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶的催化结构域,使之对单糖底物的催化活性丧失;3)降低N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶与溶酶体酸性水解酶的识别、结合,导致溶酶体酸性水解酶的甘露糖磷酸化降低。

3 黏脂贮积症Ⅱ型的主要病理特征

3.1 骨发育异常

骨改变是黏脂贮积症Ⅱ型的一个显著特征,包括:骨骼生长受损,进行性骨营养不良,破坏性的骨损害导致的胸廓畸形、后凸、畸形足、长骨和髋关节脱位等。骨骼是一种高度动态的组织,通过重塑过程进行连续更新,保留其机械特性和钙稳态。骨重塑活动由3个连续的阶段组成:破骨细胞骨吸收的激活;从分解代谢转变为合成代谢;成骨细胞修复形成新骨。有观点认为,在黏脂贮积症Ⅱ型中缺少M6P的溶酶体水解酶由于不能正常运输至溶酶体中而导致骨吸收作用增强[19]。

为分析N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶功能缺失对机体骨骼变化的影响,Kollmann等[20]构建了N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶缺陷小鼠模型,结果显示该缺陷小鼠的破骨细胞增加,同时成骨细胞活性降低;进一步的机制分析发现,在该缺陷小鼠成骨细胞中白细胞介素-6的分泌显著增加,推测这可能是促使破骨细胞生成增加的一个因素。

水解酶的高分泌是黏脂贮积症Ⅱ型的一个显著特征,这些水解酶不适当的胞外作用被认为是骨骼异常的原因之一,但是,将水解酶活性与疾病表型联系起来的机制仍然知之甚少[21]。正常情况下,组织蛋白酶K的前体通过M6P标记运输至溶酶体中,当N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶出现缺陷时,组织蛋白酶K则会被分泌到细胞外。Flanagan-Steet等[21]发现,在黏脂贮积症Ⅱ型患者中分泌到胞外的组织蛋白酶K可以通过干扰转化生长因子-β信号影响骨和软骨的发育。

3.2 肺动脉高压

肺动脉高压常见于黏膜多糖病和戈谢病,但在黏脂贮积症Ⅱ型中不常见,Kovacevic等[22]第一次在黏脂贮积症Ⅱ型患者中报道了肺动脉高压并发症。Recla等[23]报道了一位患有黏脂贮积症Ⅱ型并伴有严重肺动脉高压的男孩,他们发现该患者内皮素-1的水平升高,但是内皮素-1前体的水平是正常的,这表明内皮素-1的降解受损,而不是合成增加。因此他们认为,内皮素-1在溶酶体中降解受损是该患者肺动脉高压发生的原因之一。

组织蛋白酶A能与β-半乳糖苷酶和唾液酸酶共同组成溶酶体多酶复合物,具有激活唾液酸酶并保护β-半乳糖苷酶和唾液酸酶不被快速降解的作用[24]。组织蛋白酶A基因缺陷会导致半乳糖中毒,同时半乳糖血症患者的表型特征还包括高血压和心肌病[25～26],这表明组织蛋白酶A可能还有其他功能。Seyrantepe等[26]发现并证实组织蛋白酶A的酶活性是内皮素-1失活的重要条件。所以,在黏脂贮积症Ⅱ型患者中溶酶体缺乏组织蛋白酶A将导致内皮素-1在溶酶体中的降解过程受阻,这可能是引起患者心血管异常的因素之一。

3.3 精神运动发育迟缓

黏脂贮积症Ⅱ型患者都有明显的精神运动发育迟缓特征。Paton等[27]根据先前报道的黏脂贮积症Ⅱ型患者的突变c.2664C＞G(p.Y888X)构建了相应突变位点的小鼠黏脂贮积症Ⅱ型突变模型。该小鼠模型首次模拟了黏脂贮积症Ⅱ型患者运动功能障碍和精神运动迟缓的行为特征,表现出与黏脂贮积症Ⅱ型患者相似的表型,包括:生长发育迟缓,骨骼和面部异常,循环溶酶体酶活性增加,细胞内溶酶体贮存,寿命缩短,出现进行性神经变性病变并且浦肯野氏细胞严重丧失。在GNPTABc.3082insC突变的黏脂贮积症Ⅱ型小鼠大脑中,α-L岩藻糖苷酶、β-氨基己糖苷酶、α-甘露糖苷酶和尼曼-皮克C2蛋白进入溶酶体明显受阻,并造成神经节苷脂、胆固醇、单酰甘油磷酸盐显著积累[28],这些可能与黏脂贮积症Ⅱ型患者精神运动发育迟缓有关,但其具体机制有待进一步研究。

3.4 复发性肺炎

复发性肺炎是黏脂贮积症Ⅱ型患者常见表型之一。研究报道,1例24个月大的黏脂贮积症Ⅱ型患者6次因肺炎住院[8],有些黏脂贮积症Ⅱ型患者的第一症状就是肺炎或长期复发性肺炎[6]。Yokoi等[29]从3例散发黏脂贮积症Ⅱ型患者血样中分离了淋巴细胞亚群,经分析发现几乎所有来自患者的B细胞都含有空泡样包涵体,而CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞和单核细胞无包涵体。Otomo等[30]在黏脂贮积症Ⅱ型小鼠模型中也观察到了相同的B细胞状态,该小鼠脾脏B细胞存在空泡样包涵体,而T细胞是正常的;而且,除了B细胞成熟缺陷外,该黏脂贮积症Ⅱ型小鼠的抗原加工提呈和抗体产生都受到了影响。目前,人们在黏脂贮积症Ⅱ型患者中也得到了类似的结果,患者B细胞和记忆B细胞数量要低于正常水平;同时,血清免疫球蛋白检测显示,患者的总IgG、IgA和IgM浓度与参考值相比较低;最重要的是,黏脂贮积症Ⅱ型患者对疫苗接种的特异性抗体反应较差或无法检测到[30]。这些资料说明黏脂贮积症Ⅱ型患者免疫系统功能受损可能使肺部更易受到感染。

3.5 睡眠呼吸障碍

黏脂贮积症Ⅱ型患者气道狭窄、鼻梁下陷、脊柱后凸等异常的生理表型会影响到患者的呼吸状况,特别是在睡眠状态时可能会造成患者睡眠呼吸障碍[31]。睡眠呼吸障碍是黏脂贮积症Ⅱ型患者的常见表现,但这一潜在的危险因素常常被忽视。睡眠呼吸障碍在黏脂贮积症Ⅱ型和黏脂贮积症Ⅲ型患者中都是存在的。目前,记录黏脂贮积症Ⅱ型患者睡眠呼吸障碍的客观数据很少。Tabone等[32]揭示了5个黏脂贮积症Ⅱ型患者的睡眠质量情况,发现所有患者均存在阻塞性睡眠呼吸暂停,他们的睡眠呼吸暂停低通气指数的中位数是36次/小时(正常人＜2次/小时)。手术是治疗严重阻塞性睡眠呼吸暂停的首选方法,但对于患有黏脂贮积症Ⅱ型的阻塞性睡眠呼吸暂停患者,手术治疗的效果有限且存在很大风险,而给予持续气道正压通气能改善黏脂贮积症Ⅱ型患者的睡眠呼吸状态[32～33]。

4 黏脂贮积症Ⅱ型的支持性治疗

1986年,一位患有黏脂贮积症Ⅱ型的日本小女孩在8个月大时接受了来自她哥哥的骨髓[34],她是首例接受骨髓移植治疗的黏脂贮积症Ⅱ型患者,治疗后她的肝脏肿块减少,精神性运动发育能达到4～8个月正常小孩水平,但其他症状(如心力衰竭、关节挛缩、牙龈肥厚、皮肤紧绷、身材矮小等)没有改善,也没有进一步恶化。此外,患者的呼吸系统有所改善,对呼吸机依赖程度下降,感染频率较之前有所降低,但接受骨髓移植治疗5年后死于肺炎和肺功能不全[35]。

针对22例进行了造血干细胞移植治疗的黏脂贮积症Ⅱ型儿童的跟踪研究发现,最后一次随访的总生存率只有27%,平均死亡时间为27.6个月,值得一提的是22例患者中只有13例进行了DNA突变分析,证实为黏脂贮积症Ⅱ型[36]。这些成功接受造血干细胞移植的黏脂贮积症Ⅱ型患者血浆中的水解酶(如β半乳糖苷酶、α半乳糖苷酶、α葡糖苷酶、β氨基己糖苷酶、α甘露糖苷酶、β甘露糖苷酶)在移植后的几个月到几年仍然有显著的提高。

虽然目前黏脂贮积症Ⅱ型疾病没有良好的根治措施,但是一些有效的支持性治疗是必不可少的,比如:几乎所有黏脂贮积症Ⅱ型患者都会出现严重的牙龈增厚,这会影响日常的牙齿清洁,造成口腔疼痛、感染甚至脓肿,患者可通过牙龈切开术进行治疗并保持日常牙齿清洁[37];针对气道狭窄造成的呼吸功能不全的黏脂贮积症Ⅱ型患者,虽然因疗效有限且存在很大风险而不能进行手术干预,但持续气道正压通气是良好且必要的选择;对于出现阻塞性睡眠呼吸暂停的黏脂贮积症Ⅱ型患者,其睡眠质量的监控是很重要的,给予持续气道正压通气能改善黏脂贮积症Ⅱ型患者的睡眠呼吸状态;黏脂贮积症Ⅱ型患者免疫系统功能受损并经常性地出现肺部感染,这对患者的生命造成严重威胁,增强其免疫力、减少感染对提高存活率有积极影响[29～30]。当然,遗传咨询以及产前诊断能降低黏脂贮积症Ⅱ型的发生率。

5 展望

以M6P为标记靶向运输的溶酶体酶的种类多达50种,虽然黏脂贮积症Ⅱ型患者所有细胞和组织都缺乏N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶活性,其中成纤维细胞和间充质细胞受到的影响最为显著,但是,许多其他细胞类型(如肝细胞、库普弗细胞和白细胞)和一些器官(如肝、脾、肾和大脑)的溶酶体水解酶水平接近正常[20],提示可能存在不需要M6P识别标记的溶酶体酶转运方式。GNPTAB基因突变使溶酶体的基本功能受损,未进入溶酶体的酶、积累的未被分解的大分子物质和潜在的分子信号缺失等对人体细胞、组织、器官乃至系统的影响,都将黏脂贮积症Ⅱ型引向了更加复杂而严重的表型。虽然目前还不能全面地了解和治疗黏脂贮积症Ⅱ型,但是每一个研究进展的取得,都将为我们完整认识黏脂贮积症Ⅱ型提供重要基础,也将为患者的精确有效治疗带来希望。