李汶霖,李淑凝,王 洋,沈海娥,李志敏

(华北理工大学a.临床医学院;b.生命科学学院;c.护理与康复学院,中国河北 唐山 063210)

中性粒细胞作为抵御病原体入侵的第一道防线,具有广泛的抗菌功能。活化的中性粒细胞释放含有抗菌因子的颗粒,并通过氧化裂解产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)[1]。中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)是近些年发现的新的抗菌机制,该机制不同于凋亡和坏死,而是一种特殊类型程序性细胞死亡,这个过程被称为NETosis[2～3]。在这个过程中,中性粒细胞的细胞核失去其特征性的形状,染色质发生去致密化[4],随后,细胞核的膜和颗粒崩解,混合在一起,最终中性粒细胞释放NETs。该网状结构主要由染色质组成,附着有大量的各种杀菌蛋白质,例如抗菌肽、蛋白酶、瓜氨酸化组蛋白等。NETs可以包裹、捕捉并杀死病原体,特别是不易被吞噬的白色念珠菌和牛分枝杆菌聚集体这种结构较大的微生物[5]。NETosis的经典途径需要由NADPH氧化酶产生ROS,然而在缺乏NADPH氧化酶的情况下,线粒体ROS产生也可以触发NETosis[6]。此外,金黄色葡萄球菌可引起一种非常迅速并无需ROS的NETosis[7～8],在金黄色葡萄球菌的直接作用下,中性粒细胞的细胞核迅速变圆和浓缩,通过囊泡出芽的方式,释放出NETs的成分。这个未有ROS参与的过程说明NETs的形成并不一定依赖于ROS的触发作用,可以认为这是一种NETosis的特殊途径。一直以来,研究者都认为NETosis需要中性粒细胞的破裂死亡,而相关研究观察到,在没有中性粒细胞死亡的情况下,机体也可以触发NETosis,这种不同途径的NETosis打破了中性粒细胞的死亡是NETosis必要条件的观点[9～11]。当然,这种不同于经典途径的NETosis的具体机制和生理意义还有待阐明。

越来越多的证据表明中性粒细胞在抗病毒免疫反应中起重要作用[12～13],而由病毒诱导的NETs既可以控制病毒又能损伤宿主[14]。NETs的抗病毒免疫机制较抗其他微生物更为复杂,除了类似抗细菌的机制:依靠氧化物和非氧化物直接杀伤病毒体;通过网状结构包裹、限制病毒的扩散,NETs还可以通过间接刺激其他的免疫细胞来发挥抗病毒免疫作用,比如:激活浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells,pDCs)[12];降低T淋巴细胞的激活阈值以提高机体的抗病毒适应性免疫[13]。在NETs发挥抗病毒作用的同时,它也会给机体带来许多严重的“副作用”,随着这些病理反应机制逐渐清楚,人们意识到NETs的大量形成会造成许多疾病,比如自身免疫性疾病、呼吸困难和血栓形成等[15～16],因此有人通过减少和控制NETosis的发生来减轻这些严重的“副作用”。本文就病毒与NETs之间的相关性进行综述。

1 病毒诱导NETs产生的机制

许多病毒在体外实验中可以直接刺激中性粒细胞产生少量的NETs,中性粒细胞表面和内含体上表达的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)在 NETosis中起着重要作用[17～18]。例如:中性粒细胞通过内含体上的PRRs,如Toll样受体7/8(Toll-like receptor 7/8,TLR7/8),识别HIV-1病毒核酸,发生NETosis[19];呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的融合蛋白通过TLR4诱导小鼠发生NETosis[20];汉坦病毒(hantavirus)介导的NETosis是通过β2整合素信号转导的[15];流感病毒A也能刺激中性粒细胞直接释放NETs,但相关机制尚未确定[21]。值得注意的是,甲型流感病毒诱导的NETs不能防止继发性细菌感染[22],这说明病毒诱导的NETs在结构和功能上与细菌感染时产生的不同,也说明NETs的蛋白质成分取决于诱导刺激的类型[23]。在病毒感染的情况下,中性粒细胞可以启动除NETosis以外的其他抗病毒机制,例如释放抗病毒分子或吞噬作用,甚至启动凋亡程序[24],但目前还不清楚中性粒细胞是怎样判断诱因并决定这些不同机制的产生,可能不是单个受体的作用,而是中性粒细胞多个受体的随机组合决定了中性粒细胞的抗病毒作用方式。此外,中性粒细胞中仅仅有一部分细胞发生了NETosis,这表明仅有部分特殊亚型的中性粒细胞易受诱导发生NETosis,而不是所有中性粒细胞都能发生[4]。有研究报道,病毒也可以通过不与PRRs结合的方式间接诱导NETosis,病毒感染的内皮细胞和上皮细胞产生的炎症环境含有细胞因子和趋化因子,如白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、Ⅰ型干扰素(typeⅠinterferon,IFN-Ⅰ),这些因子可促使 NETs形成[3,25～26]。

研究表明,血小板在抗病毒防御中起着重要作用,并且其作用与NETs有关[27]。在病毒感染过程中研究者经常观察到血小板的活化过程,例如:来自小RNA病毒科的单链正义RNA病毒通过TLR7激活血小板,活化的血小板与中性粒细胞形成聚集体,其分子机制为活化血小板上的CD41与中性粒细胞上的β2整合素CD11b相互作用,最终诱导、产生NETosis,这一作用可有效地降低病毒滴度并提高宿主的存活率[28～30]。血小板和中性粒细胞聚集体的大量生成以及NETs的出现可能代表着宿主应对大量繁殖病毒的一种紧急状态,例如由汉坦病毒引起的病毒性出血热(viral hemorrhagic fever,VHF)[31～32]。

2 NETs的抗病毒作用

虽然病毒诱导NETs形成的机制现在已经研究较多,但NETs对抗病毒的免疫作用尚未完全阐明。在感染痘病毒的小鼠模型中,感染前用脂多糖诱导的NETs大大减少了病毒感染的肝细胞的数量,而这种保护作用可被DNase处理减弱[30]。NETs产生抗病毒作用的机制主要有以下3种:1)NETs的网状染色质骨架结合并固定病毒颗粒,从而机械地防止病毒传播,其中部分作用是通过静电引力来实现的,NETs组蛋白富含带正电荷的氨基酸,在静电作用下可附着在带负电荷的病毒包膜上[19]。研究报道,核心组蛋白H3和H4既可以诱导季节性流感A颗粒聚集,也可以使HIV-1失活[19,33],细胞外组蛋白能减少HIV-1的转录[34],组蛋白H1与诺沃克病毒(Norwalk virus)结合,可防止它们附着在肠细胞上[35];2)附着于NETs的染色质骨架存在抗菌分子,如髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、抗菌肽和α-防御素,它们对包膜病毒和非包膜病毒都有抗病毒活性[36];3)NETs组分通过刺激并激活其他免疫细胞的抗病毒机制,间接发挥抗病毒作用。例如:组蛋白和高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)作为损伤相关的分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),触发其他免疫细胞释放促炎细胞因子和趋化因子[37],但这一过程具有自我局限性,因为在中性粒细胞密度较高的情况下NETs会形成聚集体,进而降解细胞因子和趋化因子[38];NETs通过TLRs激活pDCs,pDCs通过释放大量的IFN-Ⅰ,在抗病毒免疫中发挥关键作用[39～42]。事实上,NETs富含被氧化的线粒体DNA,这些物质本身就能够有效地诱导Ⅰ型IFN反应[43]。另外,NETs也可以通过降低T淋巴细胞的激活阈值来提高机体的抗病毒适应性免疫[44]。

3 病毒对NETs的逃避机制

病毒逃避免疫的机制十分强大,目前已发现一些病毒具备对抗NETs形成的机制。IL-10是一种免疫抑制细胞因子,能抑制TLR诱导的ROS产生,其经常在病毒感染的背景下产生,这说明病毒可能利用IL-10作为一种NETs逃避的手段[45～47]。研究显示,HIV-1的包膜糖蛋白通过树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3,结合非整合素因子(DC-SIGN),刺激树突状细胞产生IL-10[19]。已有研究发现,包括常见的人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)和 EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)在内的一些大型DNA病毒的基因组能够编码产生IL-10的类似物,这些IL-10类似物分子可抑制免疫细胞的功能甚至造成细胞死亡,可能对NETosis具有抑制效果[48～49]。另有研究报道,2型登革热病毒(dengue virus,DENV)可通过干扰葡萄糖摄取,在ROS非依赖的晚期阶段抑制NETs的形成[50～51]。细胞因子 IL-8 也是 NETs产生的一个促进因子,而由Kaposi肉瘤相关疱疹病毒(kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)编码的潜伏相关核抗原1(latency-associated nuclear antigen-1,LANA-1)可以削弱免疫细胞IL-8的表达能力,从而抑制NETs的形成[52]。相关研究早就发现,一些细菌(如链球菌[53])能够通过分泌DNase来降解NETs,疱疹病毒也可以编码具有相似DNA酶活性的蛋白质[54],这些蛋白质被包装到衣壳中,当病毒从宿主细胞中释放出来,它们可以降解NETs,从而重新激活被NETs包裹的病毒粒子。

总体来说,病毒诱导的NETs通过直接或间接的机制减少病毒的扩散,而病毒逃避机制则以NETs的形成为目标,削弱NETs的抗病毒效应和免疫病理反应。

4 NETs对抗病毒过程中的病理效应

NETosis不仅对病原体具有有效免疫反应,也可能导致机体病理反应,如呼吸困难、自身免疫性疾病和血栓形成,NETs的形成与病原体的感染情况不平衡是导致机体病理反应的主要原因[55]。NETs对上皮细胞、内皮细胞以及肝细胞有直接的细胞毒性,它们含有的一些抗菌成分(如组蛋白)会导致组织损伤和其他病理异常[56～58];NETs的其他成分,如HMGB1,也可能在病毒相关疾病中发挥有害作用[59];此外,NETs可以阻塞分泌管道或小气道,从而导致炎症[60]。有证据表明,病毒引起的局部NETs聚集会导致机体免疫病理反应的发生,目前研究者已在严重RSV感染患儿的支气管肺泡灌洗液中检测到NETs[60];在RSV感染的小牛中,NETs在阻塞小气道的致密堵塞物中也被检出[61];在小鼠流感肺炎模型中,研究者在肺泡毛细血管损伤区域观察到了NETs的生成[62]。另一方面,现有实验表明,缺乏肽基精氨酸脱氨酶4(peptidylarginine deiminase 4,PAD4)的小鼠和野生型小鼠一样,能够有效地控制流感病毒感染,并显示出相似的存活率[63],这一结果表明,NETs在个体抗病毒免疫和病毒诱导的病理过程中不起关键作用(PAD4是催化组蛋白H3和H4去亚胺基化的酶,而H3和H4的去亚胺基化对于NETs的形成是必需的)。当然,这些研究的不同结果也可能是由于不同的实验中使用了不同的病毒株和小鼠品系。有研究显示,来自不同品系小鼠的中性粒细胞其NETosis的效率不同[64]。

如果病毒诱导的NETs聚集是一个重要的致病因素,那么抑制NETs的形成,例如通过DNA酶降解NETs,就可能消除病毒引起的疾病相关症状。一些临床试验显示,用DNA酶治疗婴儿病毒性毛细支气管炎后,患儿的临床症状得到改善,但在另一些实验中没得到相同的结果[65～67]。因此,需进一步的研究阐明病毒诱导的肺内NETs沉积的确切致病作用,并探索抗NETs治疗的有效性。

如果宿主的NETs降解和清除机制不能有效清除大量出现的NETs,大量的NETs就会出现在血液循环中,这将直接和间接地带来严重的不良影响。首先,NETs可以直接损伤血管内表面的内皮细胞[55～56];其次,NETs降解产生的一些成分会成为新的自身抗原并诱导自身抗体,这样NETs超载会引发自身免疫性损伤。事实上,许多被认为是自身免疫性疾病重要靶点的分子(如dsDNA、组蛋白、MPO、波形纤维蛋白和烯醇化酶)都是NETs成分,因此,NETs与小血管血管炎、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、弥散性血管内凝血、类风湿性关节炎和子痫前期等系统性自身免疫病的发生有关[68～69]。系统性NETs超载可能是由于清除不足或净产量增加,来自SLE患者群体的血清研究显示,DNaseⅠ活性降低,NETs降解减少[70]。除了DNaseⅠ,DNA酶Ⅰ样蛋白3(DNASE1L3)是另一种可以防止系统性NETs超载的酶,它由树突状细胞和巨噬细胞释放,可清除微粒结构中的染色质DNA,从而抑制SLE的发生[71]。有意思的是,在NETs降解酶缺陷的个体中,即使是具有相对较弱的NETs刺激能力的病毒,也可以诱导自身免疫反应的发生[71]。据此判断,NETs形成很可能是病毒和系统性自身免疫疾病之间产生联系的桥梁。

汉坦病毒属于布尼亚病毒科,通过粪口途径感染人类,可以导致VHF,患者主要临床表现为严重的肺、肾功能不全以及血管内凝血和失血性休克。汉坦病毒对NETosis有强烈的诱导效果。在DNase活性没有明显减弱的情况下,汉坦病毒感染可以通过诱导NETs的过量形成引起暂时性、系统性NETs超载。汉坦病毒在内皮细胞(其主要靶细胞)中复制,在体外实验中不会直接造成程序性细胞死亡,这表明汉坦病毒造成的病理损伤可能并不是由汉坦病毒直接造成的,而是由汉坦病毒诱导产生的免疫反应所致,其中就包括NETs引起的免疫病理反应[72～73]。在汉坦病毒感染的患者中,人们检测到高水平的NETs,在其血液循环中发现了大量的游离DNA和组蛋白[72],说明NETs的细胞毒活性可能在汉坦病毒所致病理损伤中起着重要的作用。已有研究证明,组蛋白可以促进凝血酶的生成和血管内凝血,并能增强内皮屏障的通透性[74～75]。此外,NETs还可以诱导自身抗体的形成,这也可能是汉坦病毒所致病理反应的机制之一。

登革热病毒(DENV)通过伊蚊在人与人之间传播,是引起VHF的另一种致命病毒。目前,DENV颗粒在体外实验中并没有显示出强烈的NETs诱导效果[50]。然而,体内感染DENV的细胞可通过分泌病毒非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)间接刺激NETosis,NS1通过TLR4途径激活未受感染的内皮细胞和血小板[76]。活化的内皮细胞通过释放IL-8促使中性粒细胞进入NETosis,研究显示,DENV患者体内存在高水平的IL-8和弹性蛋白酶(NETs的一个关键组成部分),并且其水平与疾病的严重程度密切相关[77];另外,活化的血小板也能刺激中性粒细胞进行NETosis。这些病理效应说明,病毒引起的NETs对机体来说可能是一把双刃剑[12]。一方面,精准聚集在感染区域的NETs,可以固定甚至中和病毒并杀死病毒感染的细胞;另一方面,如果NETs降解机制(主要依赖DNase活性)受损,或者病毒刺激NETs的能力太强,NETs导致的病理反应可能会扩散并引起健康组织损伤,甚至导致全身系统性病理反应,在这种NETs超载的情况下,自身免疫现象将被触发,可能导致全身疾病。

5 结束语与展望

现阶段的实验研究表明,细菌、真菌、寄生虫以及病毒中的大部分病原微生物都能刺激中性粒细胞发生NETosis。相对于细菌、真菌、寄生虫,虽然病毒的体积相对微小,但它仍然会被NETs捕获,这些被捕获的病毒会被NETs包裹缠绕,减少扩散。不过,NETs是否能完全将入侵的病毒杀死,依病毒种类的不同效果不尽一致,具体还需要进一步探讨。相对于NETs的益处,过多NETs产生也会造成局部甚至全身系统的病理反应,对机体造成重大的损伤,因此,深入探索病毒感染情况下NETs的形成机制将是未来NETs研究的重要方向,这对于我们控制NETs的生成,减轻其带来的“副作用”,将NETs的作用发挥到恰到好处具有重要的意义。