白璐，张晶晶，高东奇，刘承一，于晓磊，李文鑫，李青山

（承德医学院附属医院 肿瘤科，河北 承德 067000）

放疗在直接杀伤肿瘤细胞的同时能够激活机体免疫系统，通过调节免疫微环境激活免疫细胞释放免疫细胞因子，从而激活免疫功能，产生旁观者效应或远位效应[1-4]。随着放疗对免疫系统影响的研究不断深入，放疗作为佐剂激活免疫系统越来越受到重视[5]。国内外大量研究已证实放疗可以促进免疫功能，但目前确切机制尚不甚清楚。研究发现，免疫细胞及免疫细胞因子在肿瘤的发生、发展中扮演着正反双重角色，一方面，肿瘤微环境中的免疫细胞因子可以招募免疫细胞进入肿瘤病灶清除肿瘤细胞；另一方面，免疫细胞因子能够促进肿瘤细胞的生长和远处转移[6]。

为全面评价机体的免疫功能，该研究联合监测包括树突状细胞（dendritic cell, DC）在内的外周血细胞因子自然杀伤组2 成员（natural killer group 2D, NKG2D）、高迁移率蛋白1（high mobility group box 1, HMGB1），探索放疗对肺癌患者免疫功能的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年6月—2018年1月承德医学院附属医院肿瘤科的肺癌患者进行筛查，纳入经组织病理学及影像学检查明确为不可手术的肺癌患者30 例。纳入标准：①经病理组织学或细胞学证实的肺癌患者，年龄＜70 岁；②放疗总剂量60 Gy/2 Gy/30 f，预计生存期＞3 个月；③为首次胸部放疗患者，未行同期放化疗及免疫调节剂治疗；④卡氏体力状况评分标准＞70分，能够进行外周血单采的患者；⑤心、肝、肾功能正常；⑥白细胞计数（WBC）4.0×109/L ～10.0×109/L，血小板（PLT）100×109/L ～400×109/L，血红蛋白（Hb）90 ～120 g/L。排除标准：①未经病理学或细胞学证实的患者；②放疗过程中途退出的患者；③同步放化疗或放疗过程中运用免疫调节剂治疗的患者；④既往有胸部放疗史患者。

1.2 方法

1.2.1 放疗前评估 放疗前对患者进行评估：①活检病理结果；②实验室检查包括完善血常规、肝、肾功能及心电图检查；③影像学检查包括胸部CT、腹部CT。

1.2.2 放疗 所有患者采用仰卧位，双手抱肘置于额上，采用热塑料固定体位，CT 模拟定位，层厚5 mm，扫描范围为下颌至肝下缘，定位CT 影像传输至Monaco 计划系统，勾画大体肿瘤体积、临床靶区及计划靶区体积。同时勾画邻近危及器官，包括心脏、脊髓、食管等。应用医科达直线加速器调强放射治疗（IMRT），1 次/d，200 cGy/次,每周放疗5 d，放疗2、4 及6 周即为放疗2 000、4 000 及6 000 cGy 时，所有患者照射总剂量为6 000 cGy。

1.2.3 收集静脉血及检测指标 分别于放疗前1 周、放疗后2、4 及6 周空腹抽取患者静脉血5 ml，置入-80℃冰箱保存。主要检测指标：①NKG2D 及HMGB1 的动态变化；②DC 细胞存活率。

1.2.4 检测方法 ELISA 检测HMGB1、NKG2D（北京康泰合元生物技术有限公司）。①ELISA 特点：敏感性高、特异性强。实验的基本原理：采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，进行定量检测。②药盒组份：96 孔板、96 孔板覆膜、标准品、标准品稀释液、检测溶液A、检测溶液A 稀释液、检测溶液B、检测溶液B 稀释液、TMB 底物、终止液及洗涤液。③样品采集与处理：采集血清标本，将收集到的全血标本放置室温2 h，然后1 000 r/min 离心20 min，取上清液，将上清液放置-80℃液氮中冷冻保存，避免反复冻融。④操作步骤：加样，设标准孔、待测样品孔、空白孔；设标准孔，依次加入100 μl 不同浓度的标准品，空白孔加100 μl 标准品稀释液，余孔加待测样品100 μl；酶标板加上覆膜，37℃温育1 h；弃去液体，甩干，不用洗涤；每孔加检测溶液A 工作液100 μl（临用前配制），酶标板覆膜，37℃温育1 h；弃去孔内液体；每孔用350 μl洗涤液洗涤1 ～2 min，在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体；重复洗板3 次；最后1 次洗涤后，吸取或倒出剩余液体孵育30 min；弃去孔内液体，甩干，洗板5 次；每孔加TMB 液底物溶液90 μl，酶标板覆膜，37℃避光显色（不要超过30 min，当标准孔的前3或4 孔有明显的梯度蓝色，后3 或4 孔梯度不明显时，即可终止）；每孔加终止溶液终止反应，液体颜色由蓝色转为黄色；在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450 nm 波长处测量各孔的光密度（OD）值。⑤结果计算：所有OD 值都应减去空白值后再进行计算。以标准品4 000.0、2 000.0、1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5 及0.0 pg/ml 为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。根据样品OD 值在曲线图上查出相应浓度含量，再乘以稀释倍数10 即可。

1.2.5 免疫磁珠法检测DC 细胞 ①从血液中纯化出外周血单核细胞，磁珠标记非DC 计数，收集1×108个，1 500 r/min 离心10 min，弃上清液，加入300 μl 缓冲液重悬细胞加入100μl FcR Blocking Reagent 和100 μl Non-DC Depletion Cocktail 充分混合，2 ～8 ℃孵育15 min，加入5 ～10 ml 缓冲液洗涤细胞，1 500 r/min离心10 min，弃上清液，加入500 μl 缓冲液重悬细胞；②磁珠分选：去除非DC 细胞，将LD 柱放置在磁力架上，用2 ml 缓冲液润洗柱子，将细胞悬液加入柱子，收集流出液，用1 ml 缓冲液洗柱子2 次，收集流出液。流出液即为初步分离的DC 组分；③磁珠标记初步分离的DC，1 500 r/min 离心10 min 上步所得的细胞下悬液，弃上清液。用400 μl 缓冲液重悬细胞，加入100 μl DC Enrichment Cocktail。充分混合后2 ～8℃孵育15 min，加入5 ～10 ml 缓冲液洗涤细胞，1 500 r/min 离心10 min 用500 μl 缓冲液重悬细胞；④磁珠分选：筛选DC，将MS 柱放在磁力架上用2 ml 缓冲液润洗柱子，将细胞悬液加入柱子，收集含有未标记细胞的流出液用500 μl 缓冲液洗3 次，收集含有未标记细胞的流出液，与上一步的流出液合并，将柱子放入合适的收集管中，向柱子中加入500 μl 缓冲液，立刻将活塞推入柱子，收集流出液，流出液中即为磁珠分选的DC。收集分选后的DC，收集后用台盼蓝染色，蓝色代表死细胞，透明代表活细胞，用200 倍显微镜观察细胞个数，活细胞数/总细胞数之比为DC 细胞存活率。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多时间点的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，采用Pearson 相关性分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 放疗前后肺癌患者血清中活DC 细胞数的变化

放疗前1 周肺癌患者血清中活DC 细胞数为（155.70±62.35）个/μl，放疗2、4 和6 周后分别为（185.90±92.93）、（218.17±80.03） 和（126.93±61.00）个/μl，放疗前后比较，差异有统计学意义（F=6.833，P=0.002）。

2.2 放疗前后肺癌患者血清中HMGB1、NKG2D含量的变化

肺癌患者血清HMGB1 和NKG2D 含量放疗前后比较，采用单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），于放疗2、4 和6 周时逐渐下降。见表1和图1、2。

2.3 放疗前后肺癌患者血清中DC 细胞存活率的变化

DC 细胞存活率比较，采用单因素方差分析，差异无统计学意义（F=0.839，P=0.476）。见表2 和图3。

2.4 DC 与HMGB1、NKG2D 的相关性

DC 与HMGB1、NKG2D 无相关性（P＞0.05）。见表3。

表1 HMGB1 和NKG2D 不同时间点的变化 （n=30，±s）

表1 HMGB1 和NKG2D 不同时间点的变化 （n=30，±s）

注：†与放疗前1 周比较，P ＜0.05。

指标 放疗前1 周 放疗2 周 放疗4 周 放疗6 周 F 值 P 值HMGB1 91.59±5.86 72.96±4.94† 59.66±3.16† 49.02±4.51† 480.740 0.000 NKG2D 196.57±18.67 168.71±9.68† 130.04±19.17† 78.81±9.54† 348.750 0.000

图1 不同时段HMGB1 的含量变化 （n=30，±s）

图2 不同时段NKG2D 的含量变化 （n=30，±s）

表2 DC 细胞存活率的变化 （n=30，±s）

表2 DC 细胞存活率的变化 （n=30，±s）

DC 细胞存活率放疗前1 周 0.93±0.02放疗2 周 0.94±0.02 DC 细胞存活率放疗4 周 0.94±0.02放疗6 周 0.93±0.03

图3 不同时段DC 细胞存活率的变化

表3 免疫相关因子与DC 的相关性 （n=30，±s）

表3 免疫相关因子与DC 的相关性 （n=30，±s）

指标 r 值 P 值HMGB1 -0.204 0.281 NKG2D 0.105 0.580

3 讨论

HMGB1 是真核细胞核内的一种非组蛋白DNA结合蛋白，参与内源性信号的传递，是细胞坏死的一种危险信号[7-8]。研究显示，HMGB1 在胰腺癌组织中呈强阳性表达，在癌旁组织微弱表达，而在正常胰腺组织无表达，且该研究还发现HMGB1 的表达加速肿瘤的生长[9]。WATANABE 等[10]研究表明HMGB1 过表达后可抑制肿瘤细胞凋亡，其可能是一种抗细胞凋亡的癌蛋白。凋亡细胞释放的HMGB1 并不是发挥促炎功能，而是能诱导机体的免疫耐受。HMGB1 是构成肿瘤微环境重要组成部分，微环境改变导致免疫抑制，促进肿瘤的发生、发展[11-12]。而该实验研究显示，HMGB1 在放疗过程呈下降趋势，说明放射治疗促进HMGB1 大量释放的同时也在大量消耗，与YANG 等[13]研究结果相符，具体消耗机制为：①放疗导致肿瘤细胞死亡释放HMGB1，其与TLR4 结合，促进MHC-1对肿瘤抗原的加工和递呈。②放疗促进HMGB1 释放，HMGB1 进而促进APC 活化和成熟，最终促进T 细胞活化。③HMGB1 能够诱导DC 成熟。HMGB1 具有放射治疗抵抗作用，促进肿瘤细胞生长，该研究说明常规放射治疗可以降低HMGB1 的放射治疗抵抗作用，从而抑制肿瘤生长。

NKG2D 于1991年首次从NKG2 的cDNA 序列进行分析时分离得到。其主要表达于活化的NK 细胞，在T 细胞、巨噬细胞、DC 也有表达，靶细胞表面NKG2D的配体与淋巴细胞表面NKG2D 的结合可以激活淋巴细胞杀伤表达NKG2D 配体的肿瘤细胞，因此，NKG2D 在肿瘤免疫中发挥了重要作用。程妮等[14]研究证实，肺癌患者与健康人群比较，患者外周血中CD8+NKT 细胞受体NKG2D 的表达下降，随着TNM 分期的增加，NKG2D 的表达率逐渐降低。NK 细胞对放射线敏感，大量研究证实放射治疗抑制NK 细胞活性[15]，该实验检测放疗前后肺癌患者外周血中NKG2D 表达浓度，通过分析获得常规放射治疗对NKG2D 的表达为抑制作用，考虑为放疗抑制NK 细胞活性，进而抑制其释放NKG2D，与SEGOVIS 等[16]研究结果相符。

除免疫因子外，本研究还对免疫细胞进行检测。DC 为体内最强大的专职抗原提呈细胞，在抗肿瘤免疫中处于核心地位[17-18]，大多数肿瘤患者存在DC 数量减少及功能缺陷的特点，提示DC 与肿瘤的发生、发展、转移及浸润密切相关，研究发现多数细胞因子可影响DC 的发生及成熟[19-20]，包括IL-10、IL-12 等，本研究意在讨论放疗对DC 的影响，以及DC 与细胞因子HMGB1、NKG2D 的相关性，实验结果显示放射治疗前后DC 细胞存活率差异无统计学意义，说明放射治疗对DC 细胞存活率无明显影响。该研究还提示，通过检测DC 细胞数和相关免疫细胞因子HMGB1、NKG2D 在放射治疗前后不同时间段的表达水平，可能获得放射治疗联合免疫治疗产生协同效应的最佳时间区间的可靠指标。通过对DC 及相关免疫细胞因子HMGB1、NKG2D进行Pearson 相关性分析得出DC 与上述免疫细胞因子无相关，需进一步研究其原理。因免疫微环境是一个复杂多变的环境，无数的免疫细胞和细胞因子进行着复杂的信号交流活动，需要进一步探究其具体信号转导机制。

随着免疫治疗研究的不断深入，传统治疗手段与免疫治疗联合将会给肿瘤患者带来希望。目前，放射治疗联合免疫治疗新方案的实施迫切需要明确的研究方向，包括最佳放射治疗剂量、放射治疗过程中免疫治疗加入的时间点、放射治疗分割剂量及两者联合治疗的机制。对上述问题有更多的明晰，就能更有效地以放射治疗作为免疫治疗的佐剂，突破肿瘤治疗的难题。