安 双,余 飞,薛 英,刘万卉,

(1.烟台大学新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心、分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),山东 烟台264005;2.绿叶制药集团有限公司,山东 烟台 264003)

奥曲肽是一种人工合成的生长抑素类似物,为8个氨基酸组成的环状多肽化合物(图1),临床主要用于治疗肢端肥大症、消化道肿瘤、上消化道出血和急性胰腺炎等[1]．奥曲肽与其他多肽药物一样,生物半衰期非常短(消除半衰期只有1.7～1.9 h),须每天注射3次,而且是长期给药,患者顺应性非常差．奥曲肽PLGA微球一次肌注可在体内缓慢释放4周,方便了患者用药,增强了患者的依从性,在临床具有广泛应用[2]．

PLGA具有可生物降解和生物相容的特性而被广泛用于治疗性肽的缓控释制剂[3-4],然而多肽在PLGA基质中不稳定[5-6],多肽与PLGA发生亲核反应并形成酰化产物会导致药物失活、免疫原性和毒性[7-8]．因此对多肽微球药物的杂质分析及控制,是此类药物质量控制的重点．各国药典均未收载奥曲肽微球,对其有关物质的检测没有法定的方法．文献中主要是对奥曲肽微球在体外释放过程中的酰化杂质进行分析,例如MURTY等对体外释放条件下奥曲肽PLGA微球内化学修饰的肽杂质进行了分析和结构鉴定,测得发生酰化反应的位点为1位的苯丙氨酸和5位的赖氨酸[9]． SHIRANGI等在体外释放条件下对奥曲肽微球的酰化程度和酰化位点进行研究,发现奥曲肽的酰化位点有3个,分别为1位的苯丙氨酸、5位的赖氨酸和8位的苏氨醇[10]．文献中报道的奥曲肽微球的有关物质分析方法分离度不能满足要求,且对有关物质结构鉴定时对杂质结构的指认是研究的难点,文献中未提出解决方法．此外,目前未见对奥曲肽微球稳定性的研究．

本研究建立了奥曲肽PLGA微球杂质检测的液相色谱法,采用强制降解试验、影响因素试验、加速试验和长期试验对奥曲肽PLGA微球的稳定性进行了考察,使用馏分收集器对杂质进行了收集并采用LC-MS/MS对杂质的结构进行鉴定,旨在完善奥曲肽微球的质量标准,加强药品的质量控制．

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1290 型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);G7121B 型荧光检测器(美国Agilent公司);G1364C 型馏分收集器(美国Agilent公司);6530 Accurate-Mass Q-TOF质谱仪(美国Agilent公司);XPE205 型电子天平(Mettler Toledo公司); FD115 型电热鼓风干燥箱(Binder公司);TURBOVAP LV 型浓缩仪(上海倍尚);5430R 型高速离心机(德国eppendorf公司);EM-30 型扫描电子显微镜(韩国COXEM公司);3000 型激光粒度仪(英国Mastersizer公司);1200 型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);7890B 型气相色谱仪(美国Agilent公司)．

乙腈为色谱级(Merck KGaA);甲酸为色谱级(Merck KGaA);四氢呋喃为色谱级(Merck KGaA);DTT为生物技术级(Solarbio);醋酸钠为优级纯(国药集团化学试剂);氯化钠为分析纯(国药集团化学试剂);冰醋酸为色谱级(天津市科密欧化学试剂);35 %过氧化氢为分析纯(Alfa Aesar);自制PLGA微球.

1.2 微球制备

醋酸奥曲肽微球是由相分离法制备而成,制备方法为:在搅拌条件下将奥曲肽-甲醇溶液缓慢的加入PLGA-二氯甲烷溶液中,混匀后,加入处方量的硅油搅拌10 min,将上述混合溶液迅速倒入正庚烷溶液中,搅拌15 min,待微球固化后,过1 000目筛收集微球,用正庚烷洗涤3遍后,冻干72 h即得．将样品放置在-25 ℃保存待用．

1.3 微球表征

微球的粒径分布:采用马尔文3000激光粒度仪湿法测定,分散介质0.1 %吐温20溶液,衍射光由检测器收集,将信号转换为粒度分布．

扫描电子显微镜(SEM)观察形貌:将双面导电胶带粘附于铝板上,取适量干燥的微球均匀涂布在导电胶带上,喷金后进行扫描电子显微镜观察．

载药量的测定:称取醋酸奥曲肽微球约25 mg,精密称定,置25 mL容量瓶中,加入冰醋酸2 mL超声使溶解,加水稀释至刻度,摇匀,1.3×104r·min-1离心10 min,取上清液作为样品溶液进液相分析,外标法计算奥曲肽含量．色谱条件:色谱柱为WELCH XB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);以0.5 %磷酸乙腈溶液-0.5 %磷酸水溶液(24∶76)为流动相;柱温:35 ℃;流速:1.0 ml/min;检测波长:210 nm．

1.4 微球中残留溶剂测定

称取醋酸奥曲肽微球约20 mg,精密称定,加入含0.05 %乙酸乙酯的N, N-二甲基甲酰胺溶液1 mL使溶解,摇匀,静置1 h,得样品溶液,采用气相色谱法直接进样分析,以外标法计算残留溶剂含量．色谱条件为:色谱柱为DB-624(30 m×0.53 mm,3 μm);流速:5 mL/min,分流比:3∶1;进样口温度:250 ℃,检测器温度:280 ℃,柱温:50 ℃运行6 min,然后以20 ℃/min的速率升温至200 ℃并保持6 min;载气:氮气;检测器:FID．

1.5 微球中有关物质测定

1.5.1 强制降解试验 碱降解试验:6 mg·mL-1奥曲肽微球四氢呋喃溶液,加0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液1.0 mL室温避光放置2 h,加0.1 mol·L-1盐酸溶液中和至中性,加0.2 %冰醋酸0.2 %醋酸钠和0.7 %氯化钠水溶液配成含主药约0.048 mg·mL-1的溶液．

光照降解试验:6 mg·mL-1奥曲肽微球四氢呋喃溶液,放置在光照箱48 h后,加0.2 %冰醋酸0.2 %醋酸钠和0.7 %氯化钠水溶液配成含主药约0.048 mg·mL-1的溶液．

高温高湿降解试验:分别取奥曲肽PLGA微球约12 mg 2份,分别在60 ℃,75 %RH处放置4 h和7 d后,加四氢呋喃2 mL使溶解,加0.2 %冰醋酸0.2 %醋酸钠和0.7 %氯化钠水溶液配成含主药约0.048 mg·mL-1的溶液．

1.5.2 液相色谱方法 采用Inertsil ODS-2(4.6 mm×150 mm, 5 μm)色谱柱,流动相A为1.5 %甲酸水,流动相B为乙腈,梯度洗脱程序见表1,后运行12 min,流速1.7 mL·min-1,柱温25 ℃,荧光检测波长280 nm(EX)340 nm(EM)．

表1 流动相梯度

1.5.3 降解杂质收集 取强制降解试验项下样品溶液,利用上述液相方法,采用馏分收集器对奥曲肽PLGA微球在碱、高温高湿条件下降解杂质分别进行收集,用1.0 mol·L-1氢氧化钠溶液调节收集液的pH值至中性,然后用氮吹浓缩仪浓缩至杂质浓度约大于0.002 5 mg·mL-1,即得．

1.5.4 DTT还原 取各降解杂质溶液100 μL加入DTT溶液(10 mg·mL-1)10 μL,在37 ℃孵育4 h．

1.5.5 质谱条件 测试条件为:ESI离子源;正离子;扫描范围为100～2 500m/z,载气:N2;雾化器压力:30 psi;毛细管电压:4 000 V;雾化气温度:300 ℃;干燥气流速:8.0 L·min-1,鞘气温度:320 ℃;鞘气流速:10.0 L·min-1．

1.6 稳定性试验

影响因素试验:将1批自制奥曲肽PLGA微球,在高温(40 ℃)、高湿(相对湿度75%±1%)、强光照射(4 500±500 lx)条件下放置10 d,考察有关物质的变化情况．

加速试验:将3批自制奥曲肽PLGA微球模拟上市包装(硼硅酸盐管状玻璃瓶,丁基橡胶塞密封)在温度(25±2)℃、相对湿度60%±10%下放置6个月,分别于第1个月、2个月、3个月及6个月末取样,考察有关物质的变化情况．

长期试验:将3批自制奥曲肽PLGA微球模拟上市包装(硼硅酸盐管状玻璃瓶,丁基橡胶塞密封)在温度(5±3)℃下放置12个月,分别于第3个月、6个月、9个月及12个月末取样,考察有关物质的变化情况．

2 结果与讨论

2.1 奥曲肽微球特征

采用相分离法成功制备了以PLGA为载体的奥曲肽微球．使用扫描电子显微镜观察微球的形貌,SEM照片(图2)显示颗粒是球形的且表面不光滑．试验测得该微球的粒径D(0.5)为61.8 μm．微球的载药量为4.2 %．

2.2 微球中残留溶剂

采用气相色谱法对残留在奥曲肽微球中的溶剂甲醇、二氯甲烷、乙醇和正庚烷进行检测,测定结果为甲醇:未检出,二氯甲烷:0.22 %,乙醇:0.40 %,正庚烷:1.67 %．

2.3 微球中有关物质测定

2.3.1 强制降解试验分析结果 奥曲肽PLGA微球在强制降解条件下的杂质含量见表2,结果表明:在高温高湿条件下7 d时主峰明显降解为杂质1和杂质2;在高温高湿条件下4 h时，微球中杂质3,杂质4,杂质6和杂质7的含量明显增加;碱降解条件下杂质4和杂质6含量明显增加;光照降解条件下杂质1,杂质5和杂质7含量明显增加．奥曲肽PLGA微球强制降解试验色谱图见图3．

2.3.2 有关物质收集结果 首先使用HPLC对馏分收集器收集的6个杂质进行纯度分析,结果见图4．由分析结果可知,6个杂质都实现了富集,可以作为下一步结构确认的样品．其中杂质3和杂质7相对于其他收集的杂质纯度稍低,推测可能是在收集过程有其他成分干扰或发生了一定程度的降解．

Fig.2 Observation of morphology of microspheres by scanning electron microscope

表2 奥曲肽PLGA微球强制降解试验各杂质含量

2.3.3 有关物质的结构鉴定 对于收集到的有关物质,首先利用一级质谱得到各有关物质的精确分子质量,再根据二级质谱获得碎片信息,最后结合化合物的一般裂解规律,推测其可能的化学结构．奥曲肽PLGA微球各有关物质信息见表3．

LC-MS分析结果显示杂质1和杂质2的相对分子质量相比于奥曲肽减少了87,苏氨醇的相对分子质量为105,减少的相对分子质量正好等于脱去苏氨醇并结合一分子水,由此表明杂质1和杂质2应该为脱苏氨醇8奥曲肽的同分异构体．杂质3、杂质4和杂质6的相对分子质量相比于奥曲肽增加了58,乙醇酸的分子质量为76,增加的相对分子质量正好等于结合一个乙醇酸并脱去一分子水,由此表明杂质3、 杂质4和杂质6为奥曲肽与一个羟乙酰基结合的产物．杂质5和杂质7的相对分子质量相比于奥曲肽增加了116,增加的相对分子质量正好等于结合2个乙醇酸并脱去2分子水,由此表明杂质5和杂质7为奥曲肽与2个羟乙酰基结合的产物．

A.空白溶液,B.未破坏的奥曲肽PLGA微球,C.光照降解的奥曲肽PLGA微球,D.碱降解的奥曲肽PLGA微球,E.高温高湿降解(4 h)的奥曲肽PLGA微球,F.高温高湿降解(7 d)的奥曲肽PLGA微球.

图3奥曲肽PLGA微球强制降解试验色谱图

Fig.3 Chromatograms of octreotide PLGA microsphere forced degradation tests

A.高温高湿降解(7 d)的奥曲肽PLGA微球,B.收集后的杂质1,C.收集后的杂质2,D.高温高湿降解(4 h)的奥曲肽PLGA微球,E.收集后的杂质3,F.收集后的杂质4,G.收集后的杂质6,H.收集后的杂质7.

图4收集后的有关物质液相色谱图

Fig.4 Liquid chromatogram of the related substance after collection

※此列数据为DTT还原,打开二硫键后的m/z值.

为了进一步鉴定杂质的结构,采用LC-TOF/MS对还原后奥曲肽和还原后杂质1—7进行了分析,如图5和图6所示．杂质1和杂质2的MS/MS显示b1至b6的b离子与奥曲肽序列一致,且其相对分子量与[des-Thr-ol8]-Octreotide一致,因此得出结论杂质1和杂质2的结构为[des-Thr-ol8]-Octreotide且二者互为同分异构体,通过与对照品脱苏氨醇8奥曲肽对比得知杂质2为H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys,其中7位的半胱氨酸的构型为L型,而杂质1的结构根据文献的报道[11]推测为H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-D-Cys,其中7位半胱氨酸的构型为D型．杂质3的MS/MS显示b1至b7的所有b离子与奥曲肽序列一致,表明在最后一个氨基酸上发生了酰化,因此得出结论杂质3为GA-Thr8-Octreotide．杂质4的MS/MS显示b4离子未受影响,而b5增加58,表明赖氨酸(位置5)已被酰化,杂质4为GA-Lys5-Octreotide．杂质5的MS/MS显示b4离子未受影响,而b5增加116,表明赖氨酸(位置5)被2个乙醇酸酰化,杂质5为GA-GA-Lys5-Octreotide．杂质6的MS/MS显示所有b-离子偏移+58,证明N-末端的胺被酰化,杂质6为GA-Phe1-Octreotide．杂质7的MS/MS显示所有b-离子偏移+116,证明N-末端的胺被2个乙醇酸酰化,杂质7为GA-GA-Phe1-Octreotide．

2.4 稳定性试验

影响因素试验结果显示,奥曲肽微球在各影响因素条件下有关物质含量均有所增加．加速和长期试验结果显示,奥曲肽微球有关物质含量无明显变化,表明在该包装条件下奥曲肽微球样品稳定．

3 结 论

本研究采用强制降解试验、影响因素试验、加速试验和长期试验对奥曲肽PLGA微球的稳定性进行了考察,并对7个杂质进行了结构鉴定．发现高温高湿条件下奥曲肽PLGA微球中会产生脱苏氨醇8奥曲肽和其同分异构体,推测同分异构体的结构为H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-D-Cys．而奥曲肽原料在高温高湿条件下不会产生H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-D-Cys,同时与奥曲肽微球相比产生的脱苏氨醇8奥曲肽量也较少．推测原因可能是高温高湿条件下PLGA与奥曲肽结构中7位半胱氨酸的羰基反应性增强,由于PLGA与7位半胱氨酸的羰基反应使得酰胺键不稳定,8位的苏氨醇从奥曲肽结构中脱去．而PLGA与脱苏氨醇8奥曲肽的反应物不稳定,PLGA脱去的过程会使7位半胱氨酸的构型发生变化,因此奥曲肽PLGA微球中会出现杂质H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-D-Cys和H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys．

由于有关物质研究的复杂性,其常常是药品研发中的难点之一,本课题对奥曲肽PLGA微球的有关物质进行研究对完善药品质量标准,加强药品的质量控制,保障临床用药的安全性具有积极意义．