吴桂苹，谷风林*，朱科学，李云莹,2，李昌应,2，房一明

(1.中国热带农业科学院香料饮料研究所，海南 万宁 571533；2.云南农业大学，昆明 650201)

草果(Amomumtsao-koCrevost et Lemarie)为姜科、豆蔻属多年生常绿草本植物，是亚热带山区常绿阔叶林下生长的一种重要经济作物，主要分布在我国云南、广西和贵州三省部分地区，以及越南、老挝北部的部分地区。其中，云南省草果种植面积和产量均占全国的90%以上，至今已有300多年的栽培历史，种植总面积达11.98×104hm2，其中怒江州草果的种植面积达5.44×104hm2，草果已发展成怒江州的特色经济作物之一[1]。草果药食同源，不仅是烹饪佐料的上品，而且在中药中有广泛的用途，干果可作为中药材，燥湿温中，治疗脘腹胀痛，痞满呕吐，疟疾寒热，瘟疫发热之疾[2]。随着香辛调味料的深入研究和加工新技术的运用，调味料产品形态更丰富[3]、风味更稳定[4]、用途更广泛[5]，但有关草果的研究报道相对较少。国内外有部分学者研究报道了草果中挥发油的化学成分[6，7]，已初步确定了草果中的挥发性成分主要是萜烯类物质，比较了产区差异[8-10]，并初步评价了其抗氧化、抗菌等活性[11-13]，水蒸气蒸馏法常用于草果挥发油的萃取[14]，但萃取时间长，因此，借助微波辅助萃取等方法可极大缩短萃取时间[15-17]。挥发性风味物质多使用气相色谱-质谱仪进行定性鉴定，但很多风味化合物存在同分异构体，很难将其区分开来，飞行时间-质谱仪具有高灵敏度，能快速、高通量分析专一的化学结构信息[18]，目前尚未见GC-TOF-MS在草果挥发性风味物质方面的研究报道。因此，本实验利用微波无溶剂萃取仪萃取云南怒江州草果的挥发性风味物质，并用气相色谱-飞行时间质谱仪对其进行定性分析，为草果挥发性成分的开发和利用提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草果：由云南怒江州农业局提供； 正己烷(分析纯)：西陇化工股份有限公司。

NEOS-GR微波无溶剂萃取仪 意大利Milestone公司；Agilent 7890B气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦科技有限公司；Pegasus 4D GC-TOF-MS 美国LECO公司；QE-300 g高速万能粉碎机 浙江屹立工贸有限公司；HDM-100电热套 常州国华电器有限公司；AL104电子天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 草果样品的挥发油提取和含量测定

将干燥的草果全果样品用粉碎机粉碎过筛，分别收集粒度大于20目(标记为A)、20～40目(标记为B)以及小于40目(标记为C)的草果粉于密封袋内，待测。采用微波无溶剂萃取仪提取不同粉碎粒度的草果粉，参考Xue Feng等的方法略有修改，即将100 g草果粉，加入500 mL去离子水，微波功率600 W，提取60 min，读取并收集挥发油，分别标记为WBA、WBB和WBC，密封保存待测。

同时采用水蒸气蒸馏法提取作为对照，参考谷风林等的方法略有修改，即准确称取40.00 g 粒度大于20目(标记为A)、20～40目(标记为B)和小于40目(标记为C)3种不同粉碎粒径的草果粉样品，加入500 mL去离子水，连接挥发油收集器皿，进行水蒸气蒸馏4 h，利用低温循环泵冷凝，收集挥发油，分别标记为SZQA、SZQB和SZQC，用无水硫酸钠除去水分，保存待测。

草果样品中的挥发油含量根据收集到挥发油的体积除以草果粉的质量计算，以mL/100 g表示。

1.2.2 挥发性风味物质的气相色谱-飞行时间质谱仪分析鉴定

将微波无溶剂萃取和水蒸气蒸馏萃取所得的草果挥发油，分别用正己烷稀释300倍，经无水硫酸钠脱除水分后，用0.45 μm孔径尼龙膜过滤于气相色谱专用小瓶中，用于GC-TOF-MS分析。

1.2.2.1 GC分析条件

色谱柱为DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气：氦气，流速：1.0 mL/min；升温程序：50 ℃保持0.2 min，以4 ℃/min的速率升至90 ℃，以2 ℃/min的速率升至160 ℃，以20 ℃/min的速率升至220 ℃，保持2 min；进样口温度：250 ℃；进样量：1.0 μL，不分流，溶剂延迟360 s。

1.2.2.2 TOF-MS分析条件

EI离子源，电离能量：70 eV，离子源温度：200 ℃；传输线温度：250 ℃，质量数扫描范围：35～450 m/z，采集速率：10 spec/s，溶剂延迟300 s。

通过NIST 14谱库检索数据，采用峰面积归一化法计算各化合物的相对百分比含量。

1.3 数据分析

所得数据用Excel和仪器自带软件分析。

2 结果与分析

2.1 粉碎粒度对草果挥发油含量的影响

图1 不同粉碎粒径的草果粉挥发油含量Fig.1 Volatile oil content of Amomum tsao-ko powder with different grinding particle size

由图1可知，草果样品C(粉碎粒径小于40目)的挥发油含量最高，达到3.521 mL/100 g，而样品A(粉碎粒径大于20目)的挥发油含量最低。这说明草果的粉碎粒度对其挥发性油含量的萃取量有较大影响，草果粉碎粒度越细，挥发油的萃取量越高。由此可知，草果样品粉碎得越细，其挥发油越容易被提取出来。与传统水蒸气蒸馏法相比，微波无溶剂萃取法萃取量相对较低，大于20目的草果粉挥发油提取量是水蒸气蒸馏法的94.46%，但小于40目的草果粉挥发油提取量是水蒸气蒸馏法的60.83%，粉碎粒度越细，两种萃取方法所得挥发油含量差异越大，这可能与微波无溶剂萃取法的萃取时间短有关，其萃取工艺仍需要进一步优化。

2.2 草果中挥发性风味物质的分析

草果样品挥发油的GC-TOF-MS总离子流图见图2和图3，经软件自动进行解卷积和谱库匹配后，并进行手动删除色谱柱流失化合物后，分析出匹配度大于750的化合物共97种，其中采用微波无溶剂萃取法提取挥发油中的风味化合物种类和数量略高于传统水蒸气蒸馏法，其挥发性风味物质的组成见表1。

图2 微波无溶剂萃取草果挥发性风味物质的GC-TOF-MS总离子流图Fig.2 The TIC of microwave solvent-free extraction of volatile flavor substances from Amomum tsao-ko by GC-TOF-MS

图3 传统水蒸气蒸馏提取草果挥发性风味物质的GC-TOF-MS总离子流图Fig.3 The TIC of volatile flavor substances extracted by traditional steam distillation method from Amomum tsao-ko by GC-TOF-MS

表1 草果粉中挥发性风味物质的组成Table 1 Composition of volatile flavor substances in Amomum tsao-ko powder

续 表

续 表

注：ND表示未检出。

根据草果中挥发性风味物质的相对含量，将相对含量大于10%以上的作为主要风味物质，相对含量介于1%～10%的化合物作为次要风味物质，相对含量介于0.1%～1%的化合物作为微量风味物质，相对含量小于0.1%的化合物作为痕量风味物质。经比较分析，主要风味物质有4种化合物，分别是桉树醇、(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛和2-甲基-3-苯基丙醛，见图5；次要风味物质包含14种化合物，见图6；微量风味化合物有30种，痕量风味化合物有49种。

图4 草果挥发性风味物质的相对含量Fig.4 The relative content of volatile flavor substances in Amomum tsao-ko

对不同草果挥发油样品的风味物质种类以及主要风味物质和次要风味物质含量作图，由图4和表1可知，草果中挥发性风味物质主要由醛类、醇类以及少量的烯类和芳香族类化合物组成，其相对面积百分含量达到98.58%。其中，醛类化合物含量最高，达到68.67%，醇类化合物含量最高，达到26.58%。醛类化合物中相对含量较高的化合物是(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛以及2-甲基-3苯基丙醛，最高含量分别为25.85%、16.16%、17.94%，醇类化合物中相对较高的是桉树醇，最高含量为18.61%，比谷风林等研究报道的高，这不仅与原料的处理方法有关，而且与挥发性风味物质的检测仪器条件等密切相关，大多数采用GC-MS检测，鉴定出的草果挥发性风味物质数量在39种左右，目前，尚未见TOF-MS在草果挥发性风味物质的分析检测方面的研究报道，因此，本实验仅对挥发性风味物质的不同萃取方法及草果原料的粉碎粒度进行比较分析。

对草果中的主要挥发性风味物质进行分析比较，见图5，发现这些化合物的含量受草果原料的粉碎粒度、不同萃取方法的影响而存在较大差异。

图5 草果主要挥发性风味物质的相对含量Fig.5 The relative content of main volatile flavor substances in Amomum tsao-ko

由图5可知，桉树醇用水蒸气蒸馏法萃取的量相对较高，在粉碎粒径小于40目时相对含量最高，但其并不随着粉碎粒径的减小而增加。(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛和2-甲基-3-苯基丙醛2种化合物采用微波无溶剂萃取法提取的量相对水蒸气蒸馏法高，在粉碎粒径介于20～40目时相对含量最高，而(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛与(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛是同分异构体，但在草果粉碎粒径介于20～40目时水蒸气蒸馏萃取的量最高，这可能与挥发性风味化合物的性质有关，(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛有强烈的柠檬香气，易挥发。

对草果中次要挥发性风味物质的相对含量进行分析比较，见图6。

图6 草果中次要挥发性风味物质的相对含量Fig.6 The relative content of secondary volatile flavor substances in Amomum tsao-ko

注：1为α-蒎烯，2为β-蒎烯，3为α-水芹烯，4为柠檬烯，5为邻-异丙基苯，6为正辛醛，7为(E)-2-辛烯醛,8为(E)-2-癸烯醛,9为α-松油醇，10为香叶醇，11为(E)-2-十二烯醛,12为4-茚满甲醛，13为α-甲基肉桂醛，14为橙花叔醇。

由图6可知，化合物(E)-2-癸烯醛在次要挥发性风味物质中含量最高，且其采用微波无溶剂萃取的量高于水蒸气蒸馏法，在微波无溶剂萃取时，随着草果粉碎粒度的增加，萃取所得的相对含量呈缓慢增加趋势。α-松油醇、香叶醇、4-茚满甲醛、α-甲基肉桂醛和橙花叔醇5种次要风味化合物在微波无溶剂萃取中的量亦高于水蒸气蒸馏法，其中，α-甲基肉桂醛和橙花叔醇2种化合物随着草果粉碎粒径的增加相对含量呈缓慢下降趋势。α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、柠檬烯、邻-异丙基苯5种化合物用水蒸气蒸馏法萃取所得的含量远远高于微波无溶剂萃取，说明这5种化合物相对比较稳定，适合用水蒸气蒸馏法萃取。粉碎粒径和萃取方法对正辛醛的量影响较小，(E)-2-辛烯醛在萃取方法上差异不大，但粉碎粒径对其萃取量有较大影响，但不呈现规律，这可能与该化合物的性质有关。

草果中微量风味化合物和痕量风味化合物多达79种，在数量上远远多于主要和次要风味化合物，但其相对含量远远低于主要和次要风味化合物，仅占总风味化合物的6.76%～8.77%。这些微量风味化合物的相对含量在萃取方法上存在较大差异，特别是酸类化合物，如辛酸、壬酸、正己酸，在微波无溶剂萃取中的相对含量是水蒸气蒸馏法的2～4倍，而且在同一种萃取方法中，酸类化合物随着原料粉碎粒度的增加相对含量呈现先增加后降低的趋势，月桂烯、罗勒烯、桧烯等微量烯类化合物采用水蒸气蒸馏萃取的相对含量是微波无溶剂萃取法的2～10倍，且随着原料粉碎的增加相对含量呈现先降低后缓慢增加的趋势。

3 结论

采用气相色谱-飞行时间质谱仪对云南怒江草果的挥发油进行分析鉴定，共鉴定出97种挥发性风味物质，远远高于国内外的研究报道,相对含量低于1%以下的微量风味化合物和痕量风味化合物多达79种，在数量上远远多于主要和次要风味化合物，但其相对含量远远低于主要和次要风味化合物，仅占总风味化合物的6.76%～8.77%。云南怒江州草果挥发性风味物质主要由桉树醇、(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛和2-甲基-3-苯基丙醛以及少量的(E)-2-癸烯醛、α-松油醇、α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、柠檬烯、邻-异丙基苯、正辛醛、(E)-2-辛烯醛、香叶醇、 (E)-2-十二烯醛、4-茚满甲醛、α-甲基肉桂醛、橙花叔醇18种化合物组成，其相对含量占总风味化合物的91.23%～93.24%。采用微波无溶剂萃取法萃取草果挥发油与传统水蒸气蒸馏法相比，微波功率为500 W，萃取时间为60 min即可萃取出94.46%的挥发油，具有时间快、效率高等优点，经GC-TOF-MS分析鉴定，(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、2-甲基-3-苯基丙醛、α-松油醇、香叶醇、4-茚满甲醛、α-甲基肉桂醛和橙花叔醇等部分风味化合物适合用微波无溶剂萃取，桉树醇、α-蒎烯、β-蒎烯、α-水芹烯、柠檬烯、邻-异丙基苯、月桂烯、罗勒烯、桧烯等化合物适合用水蒸气蒸馏萃取。萃取前草果粉碎粒度对其萃取所得挥发油中的风味物质组成及相对含量有较大影响，粉碎越细，挥发油的萃取量越高，水蒸气蒸馏萃取的量可达到3.521 mL/100 g，远高于谷风林等(1.3～2.7 mL/100 g)、Li W等(1.82 mL/100 g)的研究报道，这可能与原料及原料的粉碎粒度有关。丁艳霞等研究报道了微波辅助提取、超声波辅助萃取和水蒸气蒸馏萃取3种方法萃取草果精油的差异，虽然微波辅助萃取(4.50%)、超声波辅助萃取(3.82%)的草果精油高于水蒸气蒸馏法(2.75%)，但其使用正己烷作为溶剂，而且水蒸气蒸馏萃取时间长达7.5 h，本实验中采用微波无溶剂萃取和水蒸气蒸馏萃取两种萃取方法所得挥发油含量差异大，这可能与微波无溶剂萃取法萃取时间短有关，其萃取工艺仍需要进一步优化，桉树醇的相对含量随粉碎粒度的增加而逐渐增加，(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛、2-甲基-3-苯基丙醛和(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛在粉碎粒度介于20～40目之间的相对含量最高。