衡文，李豪，马一凡，白光剑，邹伟

(四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644005)

纤维素酶(cellulase)是一种高活性的生物催化剂，在食品生产加工[1]、包装运输中应用广泛。纤维素酶能有效降解细胞壁中的纤维素，使胞内物质溶出，提高芫荽总黄酮产率[2]。通过纤维素复合酶解法，研究复合发酵调味品[3]，增加调味品风味的丰富度，提高冷榨大豆出油率[4]，提升产品质量。利用酶解法制备的纳米纤维素[5]，能均衡民众每日摄入营养，提高膳食水平。自然界中有很多微生物都能降解纤维素类物质，细菌[6,7]、真菌及放线菌都有大量相关报道。虽然纤维素酶生产菌株种类繁多，但多数存在纤维素酶活较低、酶系不完全等问题，影响菌株在发酵生产中的应用。目前纤维素酶生产主要有液体发酵和固态发酵两种方式，其中，液体发酵具有过程易控制、不易染菌、效率高和质量稳定等优点，且技术成熟，适用于大规模生产。

枝孢菌属是一类广泛存在于土壤、空气、污泥等环境中的常见真菌微生物，属于半知菌类，能够产生串状分生孢子。目前发现的枝孢菌多寄生于植物中或者为腐生菌，这种生活方式决定了枝孢菌具有降解木质纤维素的能力[8]。目前，研究产纤维素酶的微生物以真菌为主，如木霉属、曲霉属、青霉属、孢霉属及脉孢霉属等[9-14]。作为能够产纤维素酶的菌株，枝孢菌属产纤维素酶的报道以及在食品方面的应用均较少。

本实验室前期从自然界腐殖土、腐木中筛选获得产纤维素酶菌株，并对其进行紫外诱变、常压室温等离子体(ARTP)复合诱变菌株，使其CMC酶活达到(3.23±0.01) IU/mL，FPA酶活达到(0.51±0.02) IU/mL，较原始菌株B03CMC酶活(2.37±0.02) IU/mL提高了36.14%，较FPA酶活(0.26±0.01) IU/mL提高了97.03%[15]。本研究对枝孢菌液态发酵产纤维素条件进行了优化，为枝孢菌在食品工业方面的进一步应用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

试验菌株：枝孢菌AY-42，实验室现存菌种。

1.1.2 培养基

种子培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na) 10 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO44.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，去离子水1000 mL。

分离培养基：CMC-Na 10 g，(NH4)2SO44.0 g，蛋白胨1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，琼脂20 g，去离子水1000 mL。

液体产酶培养基：CMC-Na 10 g，蛋白胨3.0 g，酵母膏0.2 g，(NH4)2SO42.0 g，KH2PO44.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，去离子水1000 mL。

氮源优化培养基：CMC-Na 10 g，各类氮源2.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO44.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，去离子水1000 mL。

碳源优化培养基：各类碳源10 g，酵母粉2.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO44.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，去离子水1000 mL。

1.1.3 试剂与药品

柠檬酸钠缓冲液(0.05 mol/L，pH 4.8)、DNS溶液、1 mg/mL刚果红溶液、羧甲基纤维素钠、NaCl、FeSO4、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、酵母膏、(NH4)2SO4、麸皮、秸秆粉等。

1.1.4 仪器设备

MJ-250恒温培养箱、TG-16医用离心机 四川蜀科仪器有限公司；PHS-3C酸度计、YX280A型高压蒸汽灭菌锅、SW-CJ-1F净化工作台、HH-6D数显恒温水浴锅 常州普天仪器制造有限公司；V-1000可见分光光度计 翱艺仪器有限公司；SKY-2102C恒温振荡器 上海苏坤实业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 粗酶液制备

将枝孢菌AY-42接种于种子培养基中培养36 h制成种子液，按5%的接种量接种于液体产酶发酵培养基中28 ℃、180 r/min培养3 d，用纱布将菌液过滤再以8000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液，依据滤纸酶(FPA酶)活力测定粗酶液的CMC酶活。

1.2.2 培养基单因素试验

以麸皮、油菜秸秆粉、羧甲基纤维素钠、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉为碳源，以NH4Cl、NH4NO3、蛋白胨、酵母粉、(NH4)2SO4、尿素为氮源，优化培养基。将接种液以5%体积比接种到碳、氮源优化培养基中，探究菌株的最佳碳、氮源。

1.2.3 响应面试验设计

Plackett-Burman试验设计选定油菜秸秆粉、酵母粉、NaCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O 6个因素进行考察，以CMC酶活为响应值，各因素水平见表1。

表1 Plackett-Burman因素水平Table 1 Factors and levels used for Plackett-Burman design g

1.2.4 最陡爬坡试验

最陡爬坡试验是根据响应值的变化梯度确定爬坡方向，再根据显著因素的效应值确定步长。根据PB试验结果，确定影响因素最显著的3个因素为油菜秸秆粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4。最陡爬坡设计见表2。

表2 最陡爬坡试验设计表Table 2 Experimental design of steepest ascent path g

1.2.5 Box-Behnken设计

根据最陡爬坡试验结果确定Box-Behnken设计的中心点及各因素的水平，对影响产纤维素酶显著的因素是油菜秸秆粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4(见表3)。在三因素三水平上，对枝孢菌产纤维素酶发酵培养基进行优化。

表3 Box-Behnken试验设计因素水平表Table 3 Factors and levels used for Box-Benhnken design g

利用Box-Behnken设计进行响应面分析，根据试验结果使用Design-Expert软件进行数据分析，建立响应面模型，以确定最优的培养基成分组合。为了检验响应面优化结果的准确性，使用响应面优化的最佳培养基培养菌株，将试验值与预测值进行对比分析，验证模型是否准确。

1.2.6 发酵培养条件优化

通过响应面法对发酵培养基成分进行优化，使用得到的最优培养基进一步优化培养条件。其余培养条件不变，依次对接种量、摇瓶装液量、温度、转速、时间进行优化。接种量分别选择2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%的种子液；装液量选择150 mL三角瓶中盛装30，50，70，90，110 mL的液体培养基；发酵温度选择20，23，25，28，30，33，35，38 ℃；转速设置为140，160，180，200，220，240 r/min；发酵时间选择1，2，3，4，5，6，7 d。

2 结果与分析

2.1 碳、氮源对酶活的影响

图1 不同碳、氮源对产酶的影响Fig.1 The effect of carbon and nitrogen sources on enzyme production of AY-42

由图1可知，以可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖为碳源时菌株可生长，但产纤维素酶活力不高。纤维素酶在微生物中为诱导酶，在外界没有纤维素类物质诱导时微生物产纤维素酶不多，因此在可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖为碳源的培养基中菌株产纤维素酶活力不高。在以油菜秸秆粉、麸皮、羧甲基纤维素钠为碳源时菌株能生长，并且产纤维素酶活力较高，这说明在有纤维素类物质存在的情况下，菌株产纤维素酶水平得到提高，纤维素类物质对菌株产纤维素酶能力具有较好的诱导作用。综上，选择油菜秸秆粉为碳源做下一步优化。

不同氮源下培养菌株产CMC酶活见图1。试验结果显示：以酵母粉作为氮源时菌株发酵产纤维素酶活力最高，以(NH4)2SO4与蛋白胨作为氮源时产酶活力也较高，以尿素、NH4NO3作为氮源时酶活力较低，因此，选择酵母粉为氮源。

2.2 Plackett-Burman试验结果分析

确定最佳的碳源和氮源后，以AY-42为试验菌株，CMC酶活为响应值进行摇瓶产酶发酵，选定油菜秸秆粉、酵母粉、MgSO4·7H2O、NaCl、KH2PO4、FeSO4·7H2O 6个因素进行考察，A为油菜秸秆粉、B为酵母粉、C为MgSO4·7H2O、D为NaCl、E为KH2PO4、F为FeSO4·7H2O，G，H，I，J，K为虚拟变量，用以验证试验误差，试验结果见表4。

表4 Plackett-Burman试验结果表Table 4 Experimental result of Plackett-Burman

表5 Plackett-Burman试验结果分析Table 5 Experimental result analysis of Plackett-Burman

注：“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。

根据表5中结果，使用Design-Expert软件对各因素进行显著性分析，可知对酶活影响最显著的3个因素为：C MgSO4·7H2O>A 油菜秸秆粉>E KH2PO4。不同菌株对培养基的要求存在差异，陈逸文[16]在对密旋链霉菌菌株进行培养基组成优化时，通过Plackett-Burman试验得到的显著影响因素为麸皮、KH2PO4、吐温-80。董妙音[17]优化绿色木霉培养基组成时发现初始pH、CMC-Na浓度、蛋白胨这3个因素对酶活的影响最显著。纤维素酶是诱导酶，秸秆粉的存在会使菌株分泌更多的纤维素酶，Mg2+、K+对酶的生成、分泌会造成影响。

2.3 最陡爬坡试验分析

在Plackett-Burman试验基础上，进一步探究油菜秸秆粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4这3个关键因素对CMC酶活的影响，结果见表6。

表6 最陡爬坡试验结果Table 6 Experimental result of steepest ascent path

续 表

由表6试验结果可知，第3组试验纤维素酶活力达到最大，为3.72 IU，选择第3组试验作为中心点。

2.4 响应面分析

2.4.1 Box-Behnken响应面设计结果分析

根据最陡爬坡试验结果确定Box-Behnken设计的中心点及各因素的水平，以影响产纤维素酶显著的因素油菜秸秆粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4的用量做自变量，以CMC酶活作为因变量，试验设计及结果见表7。

表7 Box-Behnken设计表Table 7 Experimental result of Box-Behnken

使用Design Expert软件，对Box-Behnken设计组合试验结果进行响应面回归分析，得到菌株纤维素酶酶活与A油菜秸秆粉、C MgSO4·7H2O、E KH2PO4之间的三元二次回归方程：

Y=3.72+0.18A+0.23C+0.19E+0.0072AC-0.058AE-0.16CE-0.29A2-0.13C2-0.82E2。

回归方程的方差分析见表8，结果表明试验所用模型P<0.0001,达到极显著，说明方程拟合良好。失拟项P值为0.2663，>0.05，不显著。失拟项是评估方程可靠性的重要指标，失拟项检验不显著也说明方程模拟较好，如果显著说明方程误差占比很大，需要重新建模。方程的复相关系数R2=0.9957，说明拟合良好，试验误差较小。一次项A，C，E的线性效应均显著，二次项A2、C2、E2对产酶的曲面效应均显著，因素A，C和C，E对菌株产酶的交互作用显著，A，E对产酶的交互影响不显著。

表8 回归方程方差分析表Table 8 ANOVA analysis for regression equation

2.4.2 各因素交互作用的响应面分析

各因素对CMC酶活的交互作用响应面见图2。

图2 两两因素对CMC酶活交互影响的响应面图Fig.2 Response surface of cellulase activity of two factors interaction

由图2中a可知，油菜秸秆粉与MgSO4·7H2O的交互作用不明显，由图2中b和图2中c可知，油菜秸秆粉与KH2PO4、MgSO4·7H2O与KH2PO4的交互作用明显。本试验菌株产CMC酶活经响应面法优化培养基组成后达(3.67±0.04) IU，高于陈逸文、Han L R等[18]研究的菌株产酶水平，使用响应面优化效果较好。

2.5 液体发酵培养条件优化

试验使用优化后的培养基油菜秸秆粉12.5 g/L、酵母粉2 g/L、MgSO4·7H2O 0.75 g/L、NaCl 0.5 g/L、KH2PO45 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L，优化菌株的培养时间、装液量、接种量、转速、温度对产酶的影响，见图3。

图3 发酵条件对CMC酶活力的影响Fig.3 Effect of fermentation conditions on CMC enzyme activity

由图3中a可知，菌株在第3天进入平稳期，产酶能力在3 d时达到最高水平，从第4天开始产酶能力开始下降，与菌株生长周期基本一致。故选择发酵3 d作为最佳的发酵培养时间。由图3中b可知，在150 mL三角瓶中装液量为70 mL时产酶能力最高，CMC酶活达到(3.81±0.07) IU，超过70 mL后菌株产酶能力下降。由图3中c可知，接种量达到5%后，接种量对菌种产酶的影响不大。接种量为5%或大于5%时菌株能较快达到适宜的菌体浓度并利用培养基营养物质产酶，使得产酶能力较高。由图3中d可知，转速增至200 r/min时酶活达到最大值(4.06±0.05) IU，随后酶活随转速增加而降低。由图3中e可知，枝孢菌产酶能力随着温度的升高而升高，在培养温度为28 ℃时菌株产酶能力最好，CMC酶活达(4.20±0.06) IU，28 ℃后随着温度的上升，菌株产酶能力减弱。

3 结果与讨论

目前纤维素酶已应用到食品、发酵、饲料、能源及环保等多个领域中，具有巨大的应用前景。本文的菌株筛选于自然界腐殖土、腐木，初始酶活为(2.37±0.02) IU/mL，高于陈逸文等报道的初始酶活，具有较强的初始产酶能力。经紫外诱变、ARTP诱变得到的AY-42菌株酶活为(3.23±0.01) IU/mL，高于陈丽燕等[19]报道的菌株酶活。本试验以诱变后的菌株为基础，通过单因素试验得到培养基的最适碳源、氮源分别为油菜秸秆、酵母粉，以CMC酶活力作为响应值，对CMC酶活的关键因素进行优化，得出关键因素的最佳添加量：油菜秸秆粉12.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.75 g/L，KH2PO40.5 g/L。经验证，此条件下CMC酶活为(3.67±0.04) IU，提高了13.62%。在最佳培养基组成条件下，进一步对培养条件进行优化。结果表明，菌株的最佳培养时间为3 d，最佳接种量为5%，最适装液量为70 mL，最适转速为200 r/min，最佳培养温度为28 ℃。经过优化后CMC酶活最终达到(4.20±0.06)IU，相比优化前酶活3.23 IU提高了30.03%，高于韩立荣等[20]、任璐等[21]报道的产纤维素酶能力。

目前关于产纤维素酶的菌具有纤维素酶合成能力的微生物，多为木霉属、曲霉属、青霉属等，枝孢菌产纤维素酶的报道不多。本研究探究了枝孢菌AY-42的粗酶酶活，后续将分离纯化纤维素酶以获得纯度较高的酶，为其进一步应用于食品及调味品提供了理论基础。