王晓峰 倪益秀 莫少伟 程向东* 徐志远 吕航

胃癌是全球癌症死亡相关的第二大主要原因，仅次于肺癌［1］。槐耳清膏是槐耳真菌的热水提取部位，其临床药物槐耳金克颗粒已广泛应用于包括肝癌、乳腺癌、胃癌等多种癌症中［2］。槐耳醇提物是槐耳真菌的正丁醇提取部位，且已证实能有效抑制人胃癌细胞的体外增殖［3］。已有研究报道槐耳水提物能与顺铂（DDP）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）等化疗药物联合使用能增加化疗敏感性，槐耳醇提物和化疗药物的联合使用却较少报道［4］。多药耐药关联蛋白1（MRP1）主要是谷胱甘肽（GSH）、葡萄糖醛酸等有机阴离子的活性转运蛋白，通过主动转运泵出细胞内的外源性物质和药物从而诱导肿瘤细胞产生耐药性［5］。已有研究报道，在胃癌中，MRP1的表达与顺铂和5-氟尿嘧啶的耐药相关［6］。2019年1月至7月作者通过体外实验验证槐耳水提物的抗肿瘤作用，对比不同部位的槐耳粗提物的抗增殖效应，探讨槐耳醇提物与化疗药物联合的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器（1）细胞株：人胃癌细胞株MGC-803，BGC-823，AGS，HGC-27购于中国科学院细胞库。（2）试剂：槐耳清膏购于启东盖天力药业有限公司，槐耳清膏溶于磷酸缓冲盐溶液（PBS）中，配成100mg/ml，10ml于微孔滤膜过滤除菌后置于4℃保存待用；槐耳醇提物由浙江省中医院中心实验室提供，槐耳醇提物溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配成100mg/ml，10ml微孔滤膜过滤除菌后置于4℃保存待用；顺铂、5-氟尿嘧啶购于中国MCE公司，顺铂溶于二甲基酰胺（DMF）中，配成12mg/ml，2ml置于4℃保存待用，5-氟尿嘧啶溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配成15mg/ml，2ml置于4℃保存待用。PSB、DMF购于美国Hyclone公司；DMSO购于美国Amresco公司；胎牛血清FBS、胰蛋白酶EDTA、RPMI-1640培养基购于美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购于杭州诺扬生物技术有限公司。MRP1抗体购于英国Abcam公司。β-actin购于美国CST公司。RIPA裂解液购于美国CST公司。BCA蛋白试剂盒购于美国赛默飞公司。（3）仪器：生物安全柜、CO2恒温细胞培养箱、全波长酶标仪购于美国Thermo公司。

1.2 方法（1）细胞培养：人胃癌细胞MGC-803，BGC-823，AGS，HGC-27用 含 有10%胎 牛 血 清RPMI-1640培养基培养，并置于37℃5%CO2细胞培养箱中，隔天观察，及时处理以确保细胞状态。（2）CCK-8实验：收集对数生长期的MGC-803、BGC-823、AGS、HGC-27细胞，配制成5×104个/ml密度的细胞悬液，用排枪吸取细胞悬液接种至96孔板中，每孔100μl，并置于37℃5%CO2细胞培养箱中培养24h。设立药物组和对照组，药物组设立6个浓度梯度且每个浓度设立3个复孔，对照组为不加任何药物的RPMI-1640培养基，除此外另设空白组，加入1640培养基，但不含药物和细胞，为1640培养基背景值。每孔加入100μl药物或1640培养基后置于37℃5%CO2细胞培养箱中培养24h。每孔加入10μlCCK-8溶液，于37℃5%CO2细胞培养箱中培养1h后置于酶标仪下测在450nm处吸光度。计算细胞抑制率=（OD对照组-OD药物组）/（OD对照组-OD空白组）×100%。①单独给药：不同浓度的药物（槐耳清膏、槐耳醇提物和DDP、5-Fu）对不同胃癌细胞的影响槐耳清膏浓度梯度为0、1.25、2.5、5、10、20mg/ml；槐耳醇提物为0、31.25、62.5、125、250、500μg/ml；DDP为0、3.75、7.5、15、30、60μg/ml（AGS、HGC-27和BGC-823），0、0.375、0.75、1.5、3、6μg/ml（MGC-803）；5-Fu为0、37.5、75、150、300、600μg/ml。实验步骤同上。（注：槐耳清膏和槐耳醇提物为中药粗提物，为避免药物沉淀，测吸光度时应吸取到空白96孔板中）。②联合给药：槐耳清膏、槐耳醇提物联合DDP、5-Fu对不同胃癌细胞的影响。计算不同胃癌细胞中不同药物的IC10、IC20、IC30，设立联合组和对照组，槐耳清膏和槐耳醇提物IC20、IC30分别联合DDP和5-Fu的IC10、IC20、IC30。实验步骤同上。（3）蛋白质印迹分析：收集各GC细胞，在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解。使用BCA蛋白试剂盒定量蛋白质浓度。电泳、转膜，用含有5%牛血清白蛋白的TBST室温封闭1h。然后用相应的MRP1、β-actin的一抗4℃过夜孵育，用TBST洗涤3次，并与适当的二抗在室温下孵育2h。用TBST洗涤3次后，曝光、显影。

1.3 统计学方法采用SPSS23.0统计软件。计量资料以（±s）表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 槐耳清膏、槐耳醇提物、DDP、5-Fu单独给药对不同胃癌细胞增殖的影响实验结果表明，槐耳水提物、槐耳醇提物和DDP、5-Fu对人胃癌细胞AGS、MGC-803、HGC27、BGC823的增殖有不同程度抑制，且呈剂量依赖性，见图1。槐耳清膏对不同胃癌细 胞（AGS、MGC-803、HGC-27、BGC-823）的 半数抑制率（IC50）为10.62、4.032、5.494、4.560mg/ml；槐耳醇提物对不同胃癌细胞的IC50为165.3、97.24、203.9、166.7μg/ml；DDP对不同胃癌细胞的IC50为24.49、1.927、8.272、6.512μg/ml；5-Fu对不同胃癌细胞的IC50为117.2、236.8、88.34、234.3μg/ml。比较在不同胃癌细胞的增殖抑制率达50%时的剂量，槐耳清膏为4.031~10.62mg/ml，槐耳醇提物为97.24~203.9μg/ml，槐耳醇提物所需剂量小于槐耳清膏，表明在不同槐耳活性部位，醇提物的抑瘤效益好于水提物。

图1 槐耳水提物、槐耳醇提物、顺铂、5-氟尿嘧啶对不同胃癌细胞增殖的影响

2.2 槐耳清膏、槐耳醇提物联合DDP、5-Fu对不同胃癌细胞增殖的影响实验结果表明，槐耳清膏和槐耳醇提物的IC20、IC30联合DDP和5-Fu的IC10、IC20、IC30后均有效的增强化疗药物的肿瘤增殖抑制作用（见表1）。在各胃癌细胞中，DDP与槐耳水提物和醇提物的联合中（见图2A-D），以及5-Fu与槐耳水提物和醇提物的联合中（见图2E-H），醇提物的联合效用优于槐耳清膏。此外，随着槐耳粗提物浓度的增加，这种增强化疗药物对胃癌细胞杀伤的联合作用更加明显。对比槐耳醇提物与顺铂、5-氟尿嘧啶的联合作用（见图3A-D），在同IC值的浓度下，醇提物与DDP的联合作用比醇提物与5-Fu的联合作用更加明显。此外，低浓度的槐耳醇提物对化疗药物对胃癌细胞杀伤力的增强效果并不明显。

表1 槐耳水提物、槐耳醇提物、顺铂、5-氟尿嘧啶对不同胃癌细胞的IC10、IC20、IC30值

图2 槐耳水提物、槐耳醇提物联合化疗药物（顺铂、5-氟尿嘧啶）后对不同胃癌细胞增殖的影响（*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001）

图3 顺铂、5-氟尿嘧啶联合槐耳醇提物后对不同胃癌细胞增殖的影响（*P<0.05和**P<0.01）

2.3 槐耳醇提物能够显著抑制耐药相关蛋白MRP1的表达实验结果表明，用槐耳醇提物处理24h后的MRP1蛋白表达量显著下调，表明槐耳醇提物增加各胃癌细胞对化疗药物顺铂和5-氟尿嘧啶的敏感性可能与下调MRP1表达有关。

图4 槐耳醇提物通过抑制耐药相关蛋白MRP1影响化疗药物的敏感性

3 讨论

槐耳清膏是槐耳菌质发酵后的热水提取物，其活性成分主要是多糖蛋白，是一种易溶于水，含有多糖41.53%、氨基酸12.93%、水分8.72%棕褐色粉末。槐耳清膏（槐耳金克颗粒）已证实对癌症治疗有明显的疗效［7］。在胃癌领域中，已有大量研究报道槐耳清膏能够有效抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，诱导胃癌细胞凋亡，逆转化疗药物的耐药［8-9］。作者前期已经通过系统溶剂法将槐耳提取为水、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、乙醇五个活性部位，并证实正丁醇部位对MKN-45细胞的抑制作用最佳［10］。

本资料结果表明，槐耳水提物和槐耳醇提物均能有效抑制不同胃癌细胞的增殖，且在同一抑制率中，醇提物的药物剂量低于水提物，表明槐耳醇提物具有与槐耳水提物一样的抗肿瘤作用，且抑制效率优于水提物。化疗药物如顺铂、5-氟尿嘧啶等作为一线化疗药物广泛应用在胃癌领域。但化疗药物均存在诸多不良反应，包括神经毒性、耳毒性、免疫抑制等。已经有大量研究验证槐耳水提物可以通过多种机制增强化疗药物的抗肿瘤作用。本资料表明，槐耳醇提物与化疗药物DDP、5-Fu联用后能有效增强化疗药物对不同胃癌细胞的杀伤，且在发现槐耳醇提物与顺铂联用更有效的增强化疗药物对胃癌细胞的杀伤作用。

本资料显示，槐耳醇提物显著下调MRP1的表达。MRP1是一种膜结合糖蛋白，赋予肿瘤细胞对包括顺铂、5-Fu在内的多种化疗药物的抗性，是目前研究比较广泛导致多药耐药（MDR）的机制之一。槐耳醇提物增加顺铂和5-Fu敏感性，可能是下调MRP1的表达，从而导致顺铂、5-Fu在胞内浓度增加，增强化疗药物对胃癌细胞的杀伤。

综上所述，槐耳醇提物在体外实验中的抗肿瘤作用优于槐耳水提物，且槐耳醇提物和顺铂联合使用明显增强顺铂的肿瘤抑制作用，作者后续将从分子角度继续进行槐耳醇提物的抗肿瘤作用及如何提升顺铂的敏感性的机制研究。