宋旭红 李隆云 崔广林 丁刚

摘要：【目的】分析不同生長年限桔梗根部内生细菌种群结构及多样性，为深入理解植物—微生物互作和挖掘可培养细菌资源，建立功能细菌资源库提供理论支持。【方法】采用Illumina MiSeq高通量测序技术，对1～3年生桔梗根部内生细菌的16S rDNA V3～V4区进行PCR扩增，对PCR产物进行高通量测序。使用QIIME软件统计不同样本的群落丰富度（Chao1指数和ACE指数）及多样性（Shannon指数和Simpson指数），运用R软件计算各样本共有OTU数量，并通过Venn图呈现各样本共有和独有OTU数量。同时，借用热图和LEfSe进行不同样本间的差异显著单元分析，共同阐述不同生长年限桔梗根部内生细菌种群的多样性变化规律。【结果】不同生长年限桔梗根部内生细菌种群结构及多样性存在一定差异。随着生长年限的增加，桔梗根部内生细菌的丰富度及群落多样性持续降低，桔梗根部内生细菌特有的OTU数量持续减少。1～2年生样本的优势菌群为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、蓝细菌门（Cyanobacteria）和放线菌门（Actinobacteria），3年生桔梗根部以变形菌门、厚壁菌门、蓝细菌门和栖热链球菌门（Deinococcus-Thermus）为优势菌群。变形菌门的相对丰度在3个样本中最高，分别为76.35%、82.38%和86.46%。1年生桔梗根部内生细菌中变形菌门的相对丰度显著低于2年生和3年生样本（P<0.05），2年生与3年生桔梗样本间差异不显著（P>0.05）。芽孢杆菌属（Bacillus）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）及Dyella的相对丰度在1年生桔梗中最高，假单胞菌属（Pseudomonas）的相对丰度在3年生桔梗样本中最高。【结论】桔梗根部内生细菌具有丰富的多样性，不同生长年限桔梗根部内生细菌的群落结构不同，随着生长年限的增加，桔梗内生细菌的特有OTU、丰富度和群落多样性持续降低。生长年限是造成桔梗内生细菌种群结构及多样性变化的因素之一。芽孢杆菌属、慢生根瘤菌属、假单孢菌属及Dyella可作为可培养细菌资源进行深入研究。

关键词： 桔梗;内生细菌;Illumina MiSeq高通量测序;群落组成;多样性变化

中图分类号： S182                            文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）10-2358-09

Population structure analysis of endophytic bacteria in roots of Platycodon grandiflorum（Jacq）A. DC with different growth years

SONG Xu-hong， LI Long-yun*， CUI Guang-lin， DING Gang

（Chongqing Academy of Chinese Materia Medica/Chongqing Engineering Research Center for Fine Variety Breeding Techniques of Chinese Materia Medica/Chongqing Sub-center of National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Science， Chongqing  400065， China）

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical support for further understanding of plant microorganism interac-tion，mining culturable bacterial resources，and establishing functional bacterial resource，the population structure and diversity of endophytic bacteria in the roots of Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC with different growth years were analyzed. 【Method】The 16S rDNA sequence V3-V5 region of bacteria was amplified by PCR，and then the products of PCR amplification were sequenced with high throughput based on Illumina MiSeq platform. The community richness（Chao1 index and ACE index） and diversity（Shannon index and Simpson index） were calculated by QIIME software. R software was used to calculate the number of OTUs shared in each sample，and the number of OTUs shared and unique in each sample was showed through Venn diagram. Meanwhile，heat map and LEfSe statistical analysis were also used to estimate the diversity of endophytic bacteria population in roots of P. grandiflorum in different growth years. 【Result】There were some differences in population structure and diversity of endophytic bacteria in root of P. grandiflorum with different growth years. With the increase of growth years，the richness of endophytic bacteria and the diversity of community in the roots of P. grandiflorum continued to decrease. The number of unique OTUs was decreased continuously. The results showed that Proteobacteria，Firmicutes，Cyanobacteria and Actinobacteria were the dominant microflora in 1-year-old to 2-year-old samples，while Proteobacteria，Firmicutes，Cyanobacteria and Deinococcus-Thermus were the dominant microflora in 3-year-old sample. The relative abundance of Proteobacteria was the highest in the three samples，76.35%，82.38% and 86.46% respectively. The relative abundance of Proteobacteria in root of 1-year-old was significantly lower than that of 2-year and 3-year-old samples（P<0.05），but there was no significant difference between 2-year-old and 3-year-old samples （P>0.05）. The relative abundances of Bacillus，Bradyrhizobium and Dyella were the highest in 1-year-old samples，and that of Pseudomonas were the highest in 3-year-old samples. 【Conclusion】The endophytic bacteria in the roots of P. grandiflorum has rich diversity. The community structure of endophytic bacteria in the roots of P. grandiflorum is diffe-rent with different growth years. Specific OTUs，richness and community diversity of endophytic bacteria in the roots of P. grandiflorum continue to decrease with the increase of growth years. Plant age may be one ofthe factors causing changes in the population structure and diversity of endophytic bacteria in P. grandiflorum. Bacillus，Bradyrhizobium，Pseudomonas and Dyella can be used as cultivable bacterial resources for further study.

Key words： Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC; endophytic bacteria; Illumina MiSeq high-throughput sequen-cing; community composition;diversity change

Foundation item： National Chinese Medicine Industry Technology System construction Project（CARS-21）; Chong-qing Modern Mountain Characteristic and Efficient Agricultural Technology System construction Project（2019〔5〕）

0 引言

【研究意义】桔梗（Platycodonis Radix）为桔梗科桔梗属植物桔梗[Platycodon grandiflorum（Jacq.） A.DC]的干燥根，是我国传统大宗中药材之一，常用于治疗咳嗽痰多、胸闷不畅、咽痛音哑及肺痈吐脓（国家药典委员会，2015）。植物内生细菌是指存在于植物组织内部而对植物不产生危害的细菌（Kobayashi and Palumbo，2000），广泛存在于各种双子叶植物和单子叶植物中。植物内生细菌具有多种生物活性，包括促进植物种子萌发和生长发育（Miliute et al.，2015;Hernández-Soberano et al.，2020），增强宿主抗逆性等生物学功能（Farrar et al.，2014），还可用于害虫及植物病原菌的生物防治等（李小杰等，2018;Afzal et al.，2019;Cui et al.，2019;Jiao et al.，2020）。因此，研究桔梗根部内生细菌多样性与宿主的关系，对于探索内生细菌和宿主植物间的互作机制，发掘利用有益的内生细菌资源及促进桔梗生产具有积极意义。【前人研究进展】桔梗含有三萜皂苷、多糖、黄酮、聚炔、甾体、酚酸和脂肪酸等类型的化合物（谭玲玲等，2011，2015;田雨弘，2017）。随着生长年限增加，桔梗根部总皂苷的含量逐年增加，2年生栽培桔梗根部总皂苷含量基本接近或达到3～5年野生桔梗（李增欣等，2001），2年生栽培桔梗的株高、茎粗、分枝数等农艺性状高于3年生桔梗（杨盼盼等，2016），因此将2年作为药用桔梗的最低生长年限。在桔梗内生细菌的研究方面，Islam等（2010）对1年生、3年生和6年生桔梗内生细菌进行常规培养，分离出低G+C含量的革兰氏阳性菌——地衣形芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和短小芽孢杆菌（B. pumilus），其对辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和终极腐霉（Pythium ultimum）真菌具有较强的抑菌活力，地衣芽孢杆菌仅在3年生和6年生样本中出现，短小芽孢杆菌仅在6年生样本中出现，生长年限可能是影响桔梗根部可培养内生细菌多样性的重要因素;Cui等（2016）采用组织分离法，对桔梗根部内生菌进行分离，分离出产β-葡萄糖苷酶菌株15株，其Dyella属的1株内生菌具有高效转化人参根总皂苷和人参单体皂苷为稀有人参皂苷的生物活性。此外，不依赖培养的高通量测序技术已广泛应用于华重楼（Yang et al.，2015）、牡丹（Yang et al.，2017）、甘肃当归（Ling et al.，2019）、霍山石斛（陈韶通等，2019）、人参（雷锋杰等，2019）、枸杞（苟琪等，2020）等中药材内生细菌种群构成及群落多样性的分析。【本研究切入点】目前，采用高通量测序技术对不同生长年限桔梗根部内生细菌组成及多样性进行检测分析的研究尚无报道。【拟解决的关键问题】利用Illumina MiSeq高通量测序平台，对不同生长年限的桔梗根部内生细菌种群结构及多样性进行分析，为深入理解植物—微生物互作和挖掘可培养细菌资源，建立功能细菌资源库提供理论支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验地位于重庆市开州区紫水乡雄鹰村5组（东经108°22'，北纬31°27'，海拔1220 m）。试验开始于2015年，在土壤条件均匀一致的地块，选取9个小区（每小区面积10 m2），按照随机区组试验布置小区，第一年选取3个小区种植桔梗，以后每年种植3个小区，按照当地栽培习惯，每年复合肥（N-P2O5-K2O=15-15-15）用量为150 kg/ha。1～3年生健康桔梗采集于2018年10月31日，桔梗根部样本分别编号为P.PG.1、P.PG.2和P.PG.3。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 桔梗材料预处理 取样结束后，摘除黏附在桔梗主根的土粒，参考王丽君等（2018）的方法，先用自来水冲洗根部30 min，随后用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用2.5%次氯酸钠溶液浸泡3 min，最后用无菌水冲洗4次，放进超净工作台晾干，用最后一次清洗的无菌水100 ?L涂布在PDA培养基上，28 ℃培养72 h，观察无菌落形成后，用无菌镊子和剪刀剪取不同部位的组织，放入液氮中，以备提取DNA。

1. 2. 2 桔梗内生细菌总DNA提取和细菌扩增 桔梗内生细菌总DNA提取：采用OMEGA磁珠土壤提取试剂盒（OMEGA M5635-02）进行DNA提取，使用0.8%琼脂糖电泳进行分子大小判断，使用NanoDrop 2000对提取DNA的纯度和浓度进行测定，样品统一稀释到20 ng/?L，根据扩增情况进行相应的稀释调整。使用16S rDNA V3～V4区特异性引物，前引物338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'，后引物806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。PCR反應体系25.00 μL，其中，5×反应缓冲液5.00 μL，5×GC缓冲液5.00 μL，dNTP（10 mmol/L）2.00 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1.00 μL，NEB Q5 DNA高保真聚合酶0.25 μL，ddH2O补足至25.00 μL。扩增程序：98 ℃预变性30 s;98 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行25个循环;72 ℃延伸5 min。扩增产物（400～450 bp）进行回收纯化后用上海派森诺生物科技有限公司的Illumina MiSeq测序平台进行上机测序，并对序列进行预处理及质控。

1. 2. 3 数据分析 使用QIIME软件（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http：//qiime.org/）统计多样性指数（Shannon指数和Simpson指数）、丰富度指数（Chao1指数和ACE指数）;对OTU丰度矩阵中每个样本的序列总数在不同深度下随机抽样，以每个深度下抽取到的序列数及其对应的OTU数量绘制稀疏曲线。使用R软件（Version 3.2.0）计算各样本（组）共有OTU的数量，并通过Venn图（https：//en.wikipedia.org/wiki/Venn_diagram）直观呈现各样本（组）所共有和独有OTU所占的比例;使用R软件对Unweighted UniFrac距离矩阵分别进行NMDS分析，通过二维排序图描述群落样本的结构分布。50个优势细菌属的热图分析也由R软件分析和生成。采用SPSS 22.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 结果与分析

2. 1 桔梗根部内生细菌稀释曲线及其Venn分析

运用Illunina MiSeq测序平台对不同生长年限的桔梗根部内生细菌进行高通量测序，过滤嵌合体后，最终用于后续分析的有效序列共363318条。从图1可看出，1～3年生桔梗根部内生细菌稀释曲线趋于平坦，说明测序数据量渐进合理，该方法适用于检测不同生长年限桔梗根部内生细菌组成及多样性。

使用Venn图对样本共有OTU进行分析，从图2可看出，1年生桔梗根部内生细菌有2170个OTUs，2年生桔梗根部内生细菌有1941个OTUs，而3年生桔梗根部内生细菌有1795个OTUs，1～3年生样本特有的OTUs分别为780、474和450个。

2. 2 不同生长年限桔梗根部内生细菌α多样性分析

Chao1指数和ACE指数用来衡量群落的丰富度，数值越高，表明样本丰富度越高;Shannon指数和Simpson指数常用来衡量样本种群的多样性，数值越高，表明群落多样性越高。由表1可知，随着生长年限的增加，桔梗根部内生细菌的丰富度和群落多样性持续降低，但不同生长年限间差异均不显著（P>0.05，下同）。

2. 3 不同生长年限桔梗根部内生细菌各分类水平组成分析

根据OTU划分和分类地位鉴定结果，获得每个样本在各分类水平（门、纲、目、科、属）的具体组成，可比较不同样本在各分类水平所含有的微生物类群数量。由表2可知，随着生长年限的增加，样本中在各分类水平所含有的微生物类群数量依次降低，其中门和属分类水平下各样本间差异不显著，其他分类水平下样本间有显著差异（P<0.05，下同）。

对门分类水平上相对丰度大于0.20%的内生细菌进行统计分析。由图3可看出，不同生长年限桔梗根部内生细菌在门分类水平上的相对丰度差异较大。1年生桔梗根部内生细菌中，相对丰度依次为：变形菌门（Proteobacteria）76.35%，厚壁菌门（Firmicutes）7.79%，蓝细菌门（Cyanobacteria）6.96%，放线菌门（Actinobacteria）3.56%，栖热链球菌门（Deinococcus-Thermus）1.92%，拟杆菌门（Bacteroidetes）1.33%，绿弯菌门（Chloroflexi）0.63%，酸杆菌门（Acidobacteria）0.35%，浮霉菌门（Planctomycetes）0.29%，WPS-2 0.21%;2年生桔梗根部内生细菌中，相对丰度依次为：变形菌门82.38%，厚壁菌门7.06%，蓝细菌门4.19%，放线菌门2.17%，栖热链球菌门1.96%，拟杆菌门1.09%，绿弯菌门0.27%，酸杆菌门0.16%，浮霉菌门0.19%，WPS-2 0.03%;3年生桔梗根内部生细菌中，相对丰度依次为：变形菌门86.46%，厚壁菌门4.22%，蓝细菌门3.40%，放线菌门1.74%，栖热链球菌门2.17%，拟杆菌门0.77%，绿弯菌门0.47%，酸杆菌门0.23%，浮霉菌门0.25%，WPS-2 0.04%。

方差分析结果表明，不同生长年限的桔梗根部内生细菌中，厚壁菌门、蓝细菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、浮霉菌门和WPS-2差异不显著;1年生桔梗根部内生细菌中变形菌门的相对丰度显著低于2年生和3年生样本，2年生与3年生桔梗样本间差异不显著;放线菌门的相对丰度在3年生样本中最高，显著高于2年生和1年生样本，2年生样本显著高于1年生样本。

为更好地了解不同生长年限桔梗根部内生细菌种群的相似度及变异情况，根据所有样品在属分类水平的物种注释及相对丰度信息，选取丰度排名前50的属进行聚类分析并生成聚类热图（图4）。从图4可看出，1～3年生桔梗根部内生细菌在属分类水平的分布存在差异，在1年生桔梗根部内生细菌中，Actinidia_chinensis、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Bre-vundimonas、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、Mycobacterium、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Mese-mbryanthemum_ crystallinum_（common_iceplant）、Fa-ecalibaculum、Phenylobacterium、芽孢杆菌属（Bacillus）、Shewanella、Stenotrophomonas、Afipia、Sphingo-bium、Novosphingobium、Aquabacterium和Pelomonas明显高于2年生和3年生桔梗样本。在2年生桔梗根部内生细菌中，Lactobacillus、Amycolatopsis、Anoxybacillus、Gossypium_arboreum、Cupriavidus、Roseburia、Caulobacter、Streptococcus、Acinetobacter、Megamonas、Geobacillus、Faecalibacterium、Ochrobactrum和Erythrobacter明显高于1年生和3年生桔梗样本;在3年生桔梗根部内生细菌中，Thermus、假单胞菌属（Pseudomonas）、Clostridium_sensu_ stricto_1、Serratia、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、SM1A02、Enterobacter、anaerobic_digester_metagenome、Brevibacterium、Sphingomonas、Pantoea、Escherichia-Shigella、Methylobacterium、Noviherbaspirillum和Delftia明显高于1年生和2年生桔梗样本。

通过Galaxy在线分析平台（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/），提交属分类水平的相对丰度矩阵进行LEfSe分析，结果见表3。从表3可看出，在属分类水平上，1年生桔梗根部内生细菌具有较多的差异显著单元，共有22个;其次为2年生样本，差异显著单元为7个;3年生样本的差异显著单元为6个。随着生长年限的增加，桔梗根部内生细菌在属分类水平上的差异显著单元明显减少。由表3还可看出，1年生桔梗根部内生细菌差异显著单元有9个分布在变形菌门，其中根瘤菌科（Rhizobiales）2个，伯克氏菌科（Burkholderiaceae）3个，黄单胞菌目（Xanthomonadales）3个;9个分布在放线菌门，其中放线菌纲（Actinobacteria）1个，绿脓杆菌纲（Coriobacteriia）2个，雨孢菌科（Sporichthyaceae）2个，肠杆菌科（Ilumatobacteraceae）2个，红蝽杆菌目（Coriobacteriales）2个;2个分布在细菌门的腐螺旋菌科（Saprospiraceae）;1个分布在硬壁菌门的Dubosiella;1个分布在幽微菌门的微孢子菌目（Verrucomicrobiales）。2年生桔梗根部内生细菌中，7个差异显著单元分布在芽单胞菌目（Gemmatimonadales）4个，中村氏菌科（Nakamurella）2个，Pleomorphomonadaceae1个。在3年生桔梗根部内生细菌中，6个差异显著单元分布在5个变形菌门和1个绿弯菌门中，其中变形菌门1个，藤黄杆菌属（Luteibacter）1个，泛菌属（Pantoea）1个，肠杆菌目（Enterobacteriales）2个，热微菌科（Thermomicrobiaceae）1个。

2. 4 不同生长年限桔梗根部内生细菌β多样性分析

Beta多样性分析的主要目的是考察不同样本间群落结构的相似性，本研究采用基于Unweighted Unifrac距离矩阵的NMDS分析及UPGMA聚类分析（图5和图6）。NMDS分析不依赖于特征根和特征向量的计算，而是通过对样本距离进行等级排序，使样本在低维空间中的排序尽可能符合彼此间的距离关系（而非确切的距离数值）。因此，NMDS分析不受样本距离的数值影响，仅考虑彼此间的大小关系，对于结构复杂的数据，排序结果可能更稳定。从图5可看出，NMDS1把1年生桔梗和2年生、3年生桔梗分离开来，而NMDS2不能把2年生和3年生桔梗分开，UPGMA聚类分析结果（图6）也印证了该结论。从聚类分析及二维排序均可看出，1年生桔梗根部内生细菌与2年生和3年生桔梗根部内生菌间差异明显。

3 讨论

Illumina高通量测序技术已广泛用于甜菜（Shi et al.，2014）、牡丹（Yang et al.，2017）、火龙果（Ren et al.，2018）、桑树（Ou et al.，2019）、当归（Ling et al.，2019）等多种植物、组织的内生细菌种群多样性及种群结构变化研究。本研究基于Illumina MiSeq高通量测序平台，比较分析不同生长年限桔梗根部内生细菌的群落结构组成和多样性特征，稀释曲线趋向平坦，表明该方法适用于检测不同生长年限桔梗根部内生细菌组成及多样性。α多样性分析可反映微生物群落的物种丰富度及均匀性，本研究结果显示，随着桔梗生长年限的增加，根部内生细菌的Shannon指数、OTU数量及特有OTU数量持续下降，与Yang等（2015）对不同生长年限（4年、6年和8年）华重楼根茎中内生细菌变化趋势的研究结果基本一致，说明生长年限的增加降低了根部内生细菌的多样性。

Yang等（2017）对3种牡丹的根、叶内生细菌进行高通量测序，结果表明，变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、酸杆菌门和放线菌门为优势菌群;也有研究表明，天山北坡甜菜的内生细菌中，变形菌门、酸杆菌门、芽单胞菌和放线菌门为优势菌群（Shi et al.，2014）;变形菌门是番茄根内细菌的主要优势种群（程志强，2018），也是春季和秋季桑树优势菌群（Ou et al.，2019）。在本研究中，1～2年生桔梗根部的优势菌群为变形菌门、厚壁菌门、蓝细菌门和放线菌门，3年生桔梗根部则以变形菌门、厚壁菌门、蓝细菌门和栖热链球菌门为优势菌群。变形菌门在不同生长年限样本中的相对丰度最高，分别为76.35%、82.38%和86.46%，为桔梗内生细菌的优势菌群。变形菌门是常见的植物内生细菌门，表明桔梗内生细菌具有一般植物内生细菌的特点。

变形菌门中芽孢杆菌属、假单胞菌属、Dyella、慢生根瘤菌属等内生细菌为常见的功能菌（属）。芽孢杆菌属和假单胞菌属细菌可产生乙烯和生长素等生物调节物质，促进植物生长（Hallmann et al.，1997;Ramesh et al.，2009），还因具有产生抗生素及诱導植物对病原菌产生抗性的特性，而广泛用于病害拮抗菌的筛选（谢关林等，2003;黄曦等，2010;Berg et al.，2010;Islam et al.，2010）。Dyella属内生细菌具有高效转化人参根总皂苷和人参单体皂苷为稀有人参皂苷的生物活性（Cui et al.，2016）。在中性及微酸性条件下，慢生根瘤菌属细菌是大豆根瘤菌中的优势菌（属）（Tian et al.，2006），具有固氮促产功能。在本研究中，假单胞菌属的相对丰度在3年生样本中最高，芽孢菌属、慢生根瘤菌属和Dyella随着桔梗生长年限的增加显著降低。Islam等（2010）研究表明，可培养的芽孢杆菌属细菌种类随着桔梗生长年限的增加而降低，而在本研究中，芽孢杆菌属的相对丰度也随着生长年限的增加明显降低。采用不同研究方法得到的结论一致，表明采用该高通量测序技术阐释桔梗内生细菌种群结构及多样性具有较高的可信度。

植物内生细菌的变化受植物基因型（Shi et al.，2014;Yang et al.，2017;吴燕燕等，2018;Bashir et al.，2020）、组织（Yang et al.，2017）、生长阶段（Shi et al.，2014）及生长年限（陈韶通等，2019）等自身因素影响。同时，植物根际土壤（Afzal et al.，2019）、根部渗出物（Karnwal and Dohroo，2018）和气候状况（林标声等，2018;Vaishnav et al.，2018;Ling et al.，2019）也会影响植物内生细菌的种群结构及种群变化。在本研究中，热图聚类分析、NMDS分析及UPGMA聚类分析结果均表明，2年生及3年生桔梗根部内生细菌菌群组成较接近，二者与1年生样本组成差异明显，不同生长年限桔梗根部内生细菌的多样性有明显差异，与Islam等（2010）通过常规培养分离研究的结论相一致，表明桔梗生长年限是影响桔梗根部内生细菌种群结构与多样性变化的因素之一。