诸 君， 孔 燕， 史箫笛， 荣强全， 徐 飞

(1.江苏省南京市高淳人民医院， 江苏 南京 211300 2.江苏省南京市儿童医院检验科， 江苏 南京 210000)

甲型流感是一种由病毒感染引起的急性呼吸道疾病，具有致病性高、传染性强、病毒易变异、死亡率高等特点，资料显示，甲型流感的发病年龄较小，青少年及儿童发病人数约占全部确诊人数的60%[1]。研究表明，甲型流感患者常见死亡原因之一是继发肺部感染，目前临床上常见的继发肺部感染病原体包括肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae，SPN)及流感嗜血杆菌等，其中肺炎链球菌在重症甲型流感患儿中发生率较高，而且与非甲流引得肺部感染比较，其具有更强传染性，对于抵抗能力较差患儿，将严重影响患儿生命健康及生活安全[2]。目前由于抗生素的滥用，肺炎链球菌对青霉素、红霉素及万古霉素等多种抗生素的耐药性普遍呈上升趋势，且不同地区、不同人群肺炎链球菌的耐药性存在不同程度差异[3]，因此，临床上加强对甲型链球菌的耐药检测具有十分重要的意义。本研究通过对常用肺炎链球菌抗菌药物的耐药性及耐药基因分布进行探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2016年1月至2019年1月在南京市高淳人民医院就诊的476例甲型流感患儿为研究对象，其中男247例，女229例，年龄0.2～3岁，平均年龄(1.15±0.62)岁，纳入标准：①出现流感样症状(包括发热、鼻塞、流涕、咳嗽、咽痛、头痛、肌痛、呕吐、腹泻、乏力等)；②甲型流感病毒核酸检测阳性(咽拭子或鼻拭子阳性)；③年龄≤3岁；④患儿家属均已签署知情同意书。排除标准：①非甲流患儿；②合并严重心、脑、血管疾病患儿；③合并肝、肾功能异常患儿；④合并造血系统等疾病患儿。本研究经南京市高淳人民医院伦理委员会审批。

1.2方 法

1.2.1标本采集与鉴定:采集甲型流感患儿住院当日咽拭子或鼻拭子标本，将各个咽拭子或鼻拭子标本常规接种于血平板，将其置于35℃，5% CO2的培养箱中培养12～24h，菌落长出后，挑选血平板上呈灰白色、半透明、直径0.5～1.5cm、表面光滑、菌落周围有草绿色溶血环的可疑菌落进行纯化，经奥普托欣实验鉴别后，采用美国Biolog全自动微生物鉴定仪(购自华粤行仪器有限公司)进行菌株鉴定。

1.2.2药敏试验:采用琼脂稀释法通过全自动细菌鉴定/药敏系统对肺炎链球菌进行药敏检测确认，采用以ATCC49619作为SP药敏试验标准菌株，每次实验前均做质控对照，ATCC49619菌株购自上海北诺生物科技有限公司。红霉素、克林霉素、青霉素、万古霉素、阿奇霉素、头孢他啶、美罗培南、四环素、利奈唑胺、莫西沙星均购自中国药品生物制品鉴定所。

1.2.3基因分型检测:采用聚合酶链式反应进行检测，Zhao等[4]实验过程进行检测，pbp2B、ermB、mefA、tetM基因引物均由上海生物工程股份有限公司进行合成，相关引物序列见表1。

表1 引物序列

表2 肺炎链球菌药敏试验结果

1.3统计学分析:采用SPSS20.0统计学软件处理数据，计数资料采用“%”表示，组间差异采用“χ2”检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1药敏试验结果:476例甲型流感患儿咽拭子或鼻拭子标本中共分离出肺炎链球菌36株(7.56%)，其中对红霉素耐药35株(97.22%)，对克林霉素耐药31株(86.11%)，对青霉素耐药36株(100.00%)，对万古霉素耐药3株(8.33%)，对阿奇霉素耐药30株(83.33%)，对头孢他啶耐药32株(88.89%)，对美罗培南耐药1株(2.78%)，对四环素耐药36株(100.00%)，对利奈唑胺耐药11株(30.56%)，对莫西沙星耐药36株(47.22%)，见表2。

2.2肺炎链球菌耐药基因分型情况:36株肺炎链球菌含pbp2B耐药基因32株(88.89%)，含ermA耐药基因17株(47.22%)，含mefB耐药基因21株(58.33%)，含tetM耐药基因30株(83.33%)，见表3。

2.3不同耐药细菌的耐药基因分型情况:pbp2B、ermA、mefB、tetM基因突变与其耐药表型的测定均具有较高一致性，其中对β-内酯酰胺类抗生素青霉素、头孢他啶耐药的肺炎链球菌中pbp2B基因检测出率分别为88.89%、100.00%，对大环内酯类抗生素红霉素、阿奇霉素耐药的肺炎链球菌中ermA、mefB两种基因中的任一种或二者同时存在的耐药基因检出率分别为97.14%、93.33%，对四环素耐药的肺炎链球菌中tetM基因检出率为83.33%，见表4。

表3 肺炎链球菌耐药基因分型情况

表4 不同耐药细菌的基因分型情况

3 讨 论

甲型流感是一种急性传染性疾病，具有起病急、传染性强及流行广泛等特点，可通过呼吸道、消化道和眼结膜等多种途径进行传播[5]。临床表现特征为发热、鼻塞、流涕、咳嗽、咽痛、头痛、肌痛、呕吐、腹泻、乏力等，部分患者出现肺炎链球菌感染，少数患者出现多脏器功能衰竭、急性呼吸窘迫综合征而死亡，其中肺炎链球菌感染是甲型流感患者常见和严重的并发症，严重威胁甲型流感患者的生命安全。研究表明，流感流行造成的高病死率与并发细菌感染，尤其是肺炎链球菌感染密切相关[6]。因此，进一步加强对甲型流感患者肺炎链球菌的检测，重视二者之间的关系，并及时采取相应的治疗措施，对于降低甲型流感的死亡率具有十分重要的意义。

目前肺炎链球菌临床上首选的药物是β-内酯酰胺类抗生素，如青霉素、头孢他啶等，但近年来由于抗生素的滥用，肺炎链球菌对青霉素、头孢他啶等药品的耐药率日益严重[7]，本研究从476例甲型流感患儿咽拭子或鼻拭子标本中共分离出肺炎链球菌36株(7.56%)，通过分析肺炎链球菌对不同类型抗生素的耐药情况，以有效控制肺炎链球菌感染。方潮等[8]研究表明，肺炎链球菌对万古霉素(100.0%)，利奈唑胺(100.0%)和莫西沙星(100.0%)均敏感；而对红霉素(1.7%)、克林霉素(3.7%)和四环素(5.0%)敏感率低。本研究结果显示36株肺炎链球菌中对红霉素耐药35株(97.22%)，对克林霉素耐药31株(86.11%)，对青霉素耐药36株(100.00%)，对万古霉素耐药3株(8.33%)，对阿奇霉素耐药30株(83.33%)，对头孢他啶耐药32株(88.89%)，对美罗培南耐药1株(2.78%)，对四环素耐药36株(100.00%)，对利奈唑胺耐药11株(30.56%)，对莫西沙星耐药36株(47.22%)，与方潮等人对利奈唑胺及莫西沙星耐药率差别较大，可能是由于样本来源及地区差异等造成的。本研究与陈巧君等[3]对红霉素、克林霉素及四环素的研究结果大致相符，陈巧君等研究表明SPN对红霉素、克林霉素及四环素的耐药率分别为95.6%、84.5%、87.4%，提示临床上应慎用大环内酯类及四环素、克林霉素等抗生素，合理使用万古霉素、美罗培南及头孢素类抗生素作为替代药物，因此临床上应加强对肺炎链球菌实施药敏实验及耐药性监测，以指导临床合理使用抗生素。

肺炎链球菌青霉素结合蛋白(PBPS)共有6个亚单位，其分别由pbp1A、pbp2A、pbp1B、pbp2B、pbp2X及pbp3编码，其中肺炎链球菌的耐药主要与pbp2B基因突变有关，变异的pbp2B与β-内酯酰胺类抗生素(包括青霉素、头孢他啶等)亲和力下降，从而产生耐药性[9]。本研究结果通过分析肺炎链球菌耐药显示，36株肺炎链球菌中含pbp2B耐药基因32株(88.89%)，pbp2B基因突变与其耐药表型的测定具有较高一致性，有突变的菌株对青霉素全部耐药，提示此时临床上可考虑选用万古霉素等进行治疗，肺炎链球菌erm、mef基因是红霉素类的耐药基因，ermA、mefB两种基因中的任一种单独表达，或二者同时表达，均能够引起肺炎链球菌对大环内酯类抗生素(红霉素、阿奇霉素)耐药。本研究结果显示含ermA耐药基因17株(47.22%)，含mefB耐药基因21株(58.33%)，表明ermA、mefB基因的存在可能提示其对红霉素类抗生素耐药。本研究结果显示含tetM耐药基因30株(83.33%)，对四环素耐药的肺炎链球菌中tetM基因检出率为83.33%，提示tetM基因存在可能是引起四环素耐药的主要原因。

综上所述，肺炎链球菌对青霉素、红霉素、四环素等抗生素的耐药性较高，不适用于甲型流感患儿肺炎链球菌感染的临床治疗，肺炎链球菌的耐药性与相关耐药基因(pbp2B、ermA、mefB、tetM)的表达有关，临床上加强病原学检测，进而为合理选择抗菌药物提供可靠依据，另外本研究样本例数较少，后期准备扩大样本容量继续进行研究。