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MicroRNA-501-5p在瘢痕疙瘩中的表达及与eIF3L的靶向关系探讨

2020-01-16林简刘晓红王荣坤李涛李娜陈惠娟

中国美容医学 2020年11期
关键词:胶原疙瘩瘢痕

林简 刘晓红 王荣坤 李涛 李娜 陈惠娟

[关键词]瘢痕疙瘩;永生化成纤维细胞系;微小RNA-501-5p;真核翻译起始因子3L;靶向关系;调控

瘢痕疙瘩主要表现为机体对皮肤创伤进行修复时成纤维细胞的过度增殖,其发生发展受多种基因的调控,并调控多种通路引起病变的进展。目前研究认为其调控的通路有转化生长因子(TGF)通路、真核翻译起始因子(eIF)通路及核因子通路等[1]。微小RNA(microRNA)是近年发现的调控病变形成的因子,主要通过调控下游靶基因发挥生物学作用[2]。EIF可以受多种上游因子的调控。真核翻译起始因子3L(eIF3L)是家族中的重要成员,在调节细胞增殖及胶原合成中有重要的作用[3]。本次在TargetScan数据库中进行筛选,发现microRNA -501-5p(miR-501-5p)与eIF3L可能具有结合位点(见表1、图1)。基于此,本实验应用前瞻性实验设计,检测瘢痕疙瘩中miR-501-5p的表达,分析其与eIF3L的靶向关系。

1 资料和方法

1.1 临床资料:选择2018年5月-2019年12月确诊为瘢痕疙瘩并行手术治疗的患者41例作为观察组。纳入标准:①肿块隆起于皮肤表面,质硬,表面光滑发亮,界限欠规则,1年内无自然消退迹象;②病变超出原始损伤边缘,向周围正常组织发生浸润,蟹足状生长;③具有持续性生长、发红、痛痒等症状,无自愈倾向,不能自行消退;④病理学证实瘢痕组织内有胶原及基质成分的大量沉积,成纤维细胞很多,并有分裂像。排除标准:①局部伴癌变者;②伴有严重皮肤疾病患者;③伴有风湿免疫性疾病的患者。选择同期在医院确诊为增生性瘢痕并行手术治疗的患者41例作为对照组。纳入标准:损伤因素明确、瘢痕色泽红、质硬,高出皮肤,瘢痕的增殖不超过损伤范围。选择同期因体表皮下良性肿物切除术时切取的正常皮肤组织41例作为正常对照组。均留取术后的新鲜组织(-80℃冻存)及石蜡包埋组织。三组性别、年龄及BMI比较差异无统计学意义(P >0.05),见表2。本研究经医院伦理委员会批准,患者或家属签定知情同意书。

1.2 细胞系:永生化成纤维细胞系购自中科院上海细胞库。取出后于37℃水中解冻,加入5ml培养液,混合,以1 000转/min离心5min,倒出培养液加入适当的培养基,混合均匀并置于37℃、5% CO2的恒温箱中培养,待成纤维细胞长至80%~90%,进行细胞传代,取3~4代用于本实验。

1.3 方法

1.3.1实时荧光定量PCR检测:miR-501-5p的表达水平:应用实时荧光定量PCR(qPCR)检测3组中miR-501-5p的表达。取出冻存的标本,称取100mg进行RNA的提取。引物合成由上海莱枫生物科技有限公司完成,miR-501-5p引物上游:5-AAATATGAAACTGATGGCAA-3,下游:5-TCATGAAACTGCGCACT-3。以U6为内参,上游:5-GGAACGAGAAAGATTA-3下游:5-GGAATTCACGAAATTCCG-3。应用逆转录法合成cDNA。逆转录反应条件:37℃15min;85℃5s;4℃。试剂购自美国ABI和北京百泰克生物技术有限公司。反应程序:95℃5min,1个循环;95℃5s,64℃30s,72℃20s,共32个循环。60℃时采集信号,记录Ct值,通过2-ΔΔCt法计算目的基因。ΔΔCt=[Ct目的基因(未知样品)-Ct对照]-[Ct目的基因(校正样品)-Ct对照]。

1.3.2 免疫组化检测eIF3L和Ki67蛋白:免疫组化SP法检测瘢痕疙瘩中eIF3L和Ki67蛋白的表达。eIF3L、Ki67、二抗和DAB均购自武汉博士德生物技术公司。檢测基于石蜡包埋标本。切取4μm切片,严格按实验步骤操作,设阳性对照(上皮细胞为阳性对照)。严格按说明书操作,并由同一技师完成操作。eIF3L的阳性部位是细胞质和(或)细胞膜,Ki67的阳性部位是细胞核,选择5个热点区(400倍)进行计数,由病理科医师应用盲法完成,计算阳性率,取平均值。Ki67阳性率亦称为增殖指数。

1.3.3 双荧光素酶报告基因实验:构建eIF3L的3UTR野生型基因序列及双荧光报告基因表达的载体,构建3UTR突变的双荧光报告基因表达载体作为对照。共转染荧光素酶报告基因质粒及miR-501-5p mimics,避光下检测荧光素酶表达,观察miR-501-5p与eIF3L的3UTR结合情况。

1.4 统计学分析:应用SPSS 13.0进行分析,计量资料应用均数±标准差表示,两组间比较应用t 检验,多组间比较应用方差分析(SNK法行两两比较),率的比较应用卡方检验。同时应用Spearman相关分析,均以P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组miR-501-5p表达水平比较:观察组、对照组和正常对照组miR-501-5p表达比较差异有统计学意义(经SNK法行两两比较,P<0.05)。见表3、图2。

2.2 miR-501-5p在不同临床病理特征分组中的表达比较:观察组中miR-501-5p的表达在有无家族史及不同病程的分组中差异有统计学意义(P <0.05)。而在不同性别、年龄及Ki67增殖指数的分组中差异无统计学意义(P >0.05)。见表4。

2.3 瘢痕疙瘩组织中miR-501-5p与eIF3L的相关性:免疫组化检测瘢痕疙瘩中eIF3L表达的阳性率为5%~70%,平均24.5%,相关分析显示瘢痕疙瘩中miR-501-5p和eIF3L具有正相关性(r =0.69,P=0.024)。见图3~4。

2.4 eIF3L mRNA的3UTR是miR-501-5p的直接靶点:构建含有野生型eIF3L mRNA 3-UTR序列的pGL3-basic质粒(pGL3-eIF3L-WT)和miR-501-5p结合位点缺失的突变型eIF3L mRNA 3-UTR序列的质粒(pGL3-eIF3L-MT),分别与空载体转染组、miR-501-5p转染组的细胞后培养24h,通过双荧光素酶报告基因试盒检测荧光素酶的表达。结果显示miR-501-5p转染组能引起转染pGL3-eIF3L-WT的细胞系中荧光素酶活性降低,而对pGL3-eIF3L-MT组荧光素酶活性无明显影响,提示eIF3L mRNA的3UTR是miR-501-5p的直接靶点。见图5。

3 讨论

瘢痕疙瘩是一种皮肤的良性增生性疾病,具有恶性肿瘤向周围正常组织浸润性生长的特点,可以长在体表的任何部位并且伴有难以忍受的瘙痒和刺痛感,严重影响患者的生活质量。此外,瘢痕疙瘩组织易发生感染、破溃,甚至癌变为瘢痕癌。近年研究发现瘢痕疙瘩病变组织中与肿瘤生长相关的基因可以出现异常失调[4-5]。MicroRNA表达失调可能是瘢痕疙瘩中重要的分子进展因素。有研究显示miR30a 5p通过靶基因BCL2调控瘢痕疙瘩的细胞凋亡和增殖,其可能是治疗的重要靶点[6]。miR-501-5p是在基因库中筛选出来的,主要是与瘢痕疙瘩病变的形成和进展有关[7-8]。miR-501-5p对下游的增殖因子和凋亡因子有明确的调控作用,也是其发挥作用的重要方式[9-10]。

本研究结果显示瘢痕疙瘩中miR-501-5p的表达明显高于对照组和正常对照组,提示miR-501-5p高表达是引起瘢痕形成的重要促进因子。结果显示miR-501-5p的表达与家族史有关,其与遗传因素及家族聚集性发病特征的具体机制有待更深入的实验证实。结果显示miR-501-5p与病程有关,提示miR-501-5p與瘢痕疙瘩的生长密切相关。病程长的患者病变体积大,病变细胞增殖活跃且具有较多的粗大胶原,因此miR-501-5p与病程的相关性可能与病变生长过程中胶原的形成及病变增长密切相关[11]。瘢痕疙瘩的浸润性生长与其具有肿瘤性浸润性生长的特点有关,miR-501-5p高表达对瘢痕疙瘩生长的作用可能与miR-501-5p对肿瘤浸润性生长的作用相似[12]。研究发现miR-501-5p与eIF3L呈正相关性,提示二者具有协同正向作用,双荧光素酶基因报告实验验证了miR-501-5p与eIF3L的靶向作用,提示二者的通路作用存在,miR-501-5p为eIF3L的上游因子。EIF3L在病变形成中具有促进细胞增殖和抑制凋亡的作用,其高表达可以引起病变的生长[13]。由于eIF3L可能是调节翻译的重要蛋白,因此瘢痕形成过程可能更多依赖于细胞翻译后的调控作用。本研究是在基因学及组织学的角度的进行的研究,由于eIF3L在作用过程中与基质金属蛋白酶等因子有关,因此eIF3L对细胞胶原化的形成及纤维细胞的增生可能具有明确的促进作用。有研究显示瘢痕疙瘩组织内部呈现乏氧状态,eIF3L与缺氧相关蛋白VEGF和HIF-1a均有关[14],提示eIF3L在病变进展中的作用可能涉及多种细胞因子间的联合作用。作为上游因子的miR-501-5p对eIF3L具有的调控作用调节着细胞增殖、胶原化形成、缺氧后胶原的增生等生物学过程[15-16],但是其具体通路后续研究中应当继续关注。

总之,瘢痕疙瘩中miR-501-5p高表达,与家族史及病变增生程度相关,miR-501-5p与eIF3L的表达具有靶向关系。

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