刘 畅, 张 乐， 朱耀辉， 孙克诚， 何亚兰， 王守开， 丁艳梅，胡闪闪， 贺 焱， 李 磊

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

对乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)在临床上是一种常用的解热镇痛类非处方药[1]，正常剂量范围内服用APAP具有良好的治疗作用，但长期或过量服用APAP则会造成严重的药物性肝损伤[2]。在我国，许多患者对其安全性的认识存在着误解，故在使用方面存在较大的随意性，从而过量或者长时间服用含该成分的药物，导致一系列的不良反应。其中,最不容忽视的是造成急性药物性肝损伤甚至肝功能衰竭，危及生命[3-4]。

近年来，随着不断深入的研究，氧化应激与APAP诱导的急性肝损伤的发生息息相关，但APAP造成急性肝损伤的作用机理目前尚未明确。AS-IV为中药黄芪的主要活性成分之一，具有提高免疫力、抗自由基、抗炎、抗氧化、降低血糖与心血管保护等药理作用[5-7]。随着对AS-IV研究不断深入，它的药理活性和作用机制相继被发现，尤其在治疗肝损伤方面具有广泛的药理作用[8-10]，其保肝作用主要与抗氧化作用相关。但对于AS-IV是否能够预防治疗APAP所诱导的药物性急性肝损伤，目前研究较少。本试验旨在通过建立APAP急性肝损伤小鼠模型，探讨AS-IV对APAP诱导小鼠的急性肝损伤的保护作用以及其作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性清洁级ICR小鼠40只购于南京青龙山动物繁殖场，合格证编号：No.201710241，体重20±2 g，适应性饲养1周后进行试验。

1.1.2 主要试剂 AS-IV和APAP均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羧甲基纤维素钠购于国药集团化学试剂有限公司；谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)试剂盒(批号：20170428)，谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)试剂盒(批号：20170420)，SOD测定试剂盒(批号：20170513)，GSH测定试剂盒(批号：20170510)与丙二醛(Malondialdehyde，MDA)测定试剂盒(批号：20170520)均购于南京建成生物工程研究所；NF-κB p65抗体，Nrf2抗体均购于Abbkine公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及处理 将40只清洁级ICR健康小鼠随机分为4组：空白对照组、APAP模型组(400 mg/kg)、AS-IV低剂量组(20 mg/kg)、AS-IV高剂量组(40 mg/kg)，每组10 只。空白对照组和模型组灌胃0.2 mL的5%羧甲基纤维素钠，而低剂量组和高剂量组分别灌胃20 mg/kg和40 mg/kg的AS-IV，每天1次，连续灌胃7 d后，除空白对照组外，余下三组按照400 mg/kg的剂量灌胃APAP，染毒4 h后摘眼球采血后颈椎脱臼处死小鼠，血液于室温静置1～2 h，待血液充分凝固后，4 000 r/min离心15 min分离血清。分离肝脏，于相同位置取大小合适的一块肝组织置于4%多聚甲醛中固定，其余组织迅速置于-80 ℃储存，用于后续试验。

1.2.2 血清转氨酶的测定 按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书测定小鼠血清ALT与AST的活力。

1.2.3 肝脏组织抗氧化指标测定 准确称取30 mg肝脏取出解冻，加入9倍体积的生理盐水，置于冰上研磨，制成10%肝脏匀浆液，2 500～3 000 r/min离心10 min，取上清，按照试剂盒说明书操作检测小鼠肝脏GSH和MDA的含量与SOD的活力。

1.2.4 免疫组化检测Nrf2、NF-κB p65的表达 分离小鼠肝脏经4%多聚甲醛固定，常规方法进行组织包埋并制备组织切片，封闭后按照NF-κB p65(1∶200)，Nrf2(1∶200)孵育一抗过夜，PBS洗涤3次后，37 ℃孵育二抗1 h，然后DAB显色，二甲苯透明，中性树胶封片后，镜检观察免疫组化染色结果。

1.2.5 数据分析 使用IBM SPSS 19.0软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 AS-IV对APAP诱导急性肝损伤小鼠血清中转氨酶活性的影响

图1 AS-IV对APAP诱导的急性肝损伤血清中ALT、AST的活力影响

如图1所示，与空白对照组相比，APAP(400 mg/kg)诱导的急性肝损伤小鼠血清中ALT和AST显著增高(P<0.01)，表明造模成功。与模型组相比，AS-IV(20 mg/kg)和AS-IV(40 mg/kg)极显著的抑制了APAP诱导肝损伤所造成的ALT和AST升高的现象(P<0.01)，提示AS-IV对于APAP诱导的肝损伤具有一定的保护作用。

2.2 AS-IV对APAP诱导肝损伤小鼠GSH、MDA的含量与SOD活力的影响

表1 AS-IV对肝脏组织GSH含量、SOD活力与MDA含量的影响

注：与空白对照组相比：**表示P<0.01,***表示P<0.001；与模型组相比：##表示P<0.01，###表示P<0.001。

如表1所示，模型组小鼠肝脏中GSH的含量与SOD的活力均低于空白对照组(P<0.01，P<0.001)，而MDA则高于空白对照组(P<0.001)，说明APAP可以造成肝脏的氧化应激。而AS-IV(20 mg/kg)和AS-IV(40 mg/kg)的GSH、SOD均高于模型组(P<0.01，P<0.001)，MDA低于模型组(P<0.001)，且AS-IV(40 mg/kg)组数据显示尤为明显。从而不难看出，在APAP诱导急性肝损伤的过程中，AS-IV对于GSH，SOD的降低和MDA的升高有着明显的抑制作用，通过抗氧化对肝脏起到一定的保护作用。

2.3 AS-IV对Nrf2、NF-κB p65表达的影响

如图2所示，APAP模型组与空白对照组相比，发现APAP模型组中Nrf2的表达明显受到了抑制(图2B)，而在给予AS-IV后，肝静脉周围组织中Nrf2的表达情况逐渐升高(图2C)，并且随着AS-IV浓度的增加，升高趋势越明显。这表明在APAP诱导的急性药物肝损伤中，AS-IV能够激活Nrf2通路，使其表达情况显著升高，进而通过抗氧化的作用改善药物性肝损伤。

NF-κB是一个由p50、p65两种亚基组成的一个蛋白二聚体，存在于多种细胞且是多条信号通路的汇集点，有着至关重要的作用。据研究表明，NF-κB p65的高表达与急性肝损伤有着密切的联系[11]。而在图3中，与空白组(图3A)相比，APAP模型组(图3B)NF-κB p65的表达情况显著增高，在给予AS-IV后，AS-IV低剂量组(图3C)的NF-κB p65表达情况未发生明细的变化，但AS-IV高剂量组(图3D)的NF-κB p65表达情况受到了显著抑制。结果表明了AS-IV对于APAP诱导的NF-κB p65高表达有一定的抑制作用。

图2 AS-IV对肝脏组织Nrf2表达的影响

图3 AS-IV对肝脏组织NF-κB p65表达的影响

3 结论与讨论

大量的研究表明Nrf2转录因子介导的信号通路在机体的抗氧化损伤方面起到重要的作用[21]。作为最重要的抗氧化转录因子，Nrf2在防止APAP诱导的肝毒性中发挥关键作用[22]，一般情况下，Nrf2主要与Keap1结合为无活性的复合物存在于细胞质中，当受到外界的刺激后Nrf2-Keap1复合物解偶联，Nrf2与抗氧化反应元件(ARE)结合，调控下游抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶的表达，保护机体免受氧化损伤[23]。我们的结果显示AS-IV预处理增强了Nrf2的表达(图2)。大量研究表明，氧化应激是可激活NF-κB促进炎症因子的表达[24]，而具有代表性的亚基p65(NF-κB p65)在炎症反应调控中具有关键作用，高表达的NF-κB p65与急性肝损伤有着密切的联系，在被ROS触发后，NF-κB p65从细胞质转移到细胞核，从而激活参与炎症过程的促炎细胞因子的表达[25]，研究结果表示当Nrf2激活并与抗氧化剂相关元素结合时NF-κB p65表达量降低(图3)，说明Nrf2通路可以作为APAP诱导肝损伤的有效途径。说明黄芪甲苷在抗氧化方面具有很强的作用，为该药物临床上用于缓解APAP诱导的肝损伤提供了实验依据。