刘 毅 叶颖晓 阮 元 刘 淼 麻兵继*

（1.安庆医药高等专科学校药学系， 安徽安庆246052； 2.河南农业大学农学院， 河南郑州450000）

植物内生真菌指的是生活在健康植物组织间隙或植物细胞内且不会引起宿主明显的感染症状的真菌。植物内生真菌种类多、分布广，还能够产生多种多样的活性天然产物［1⁃2］。内生真菌长期生活在寄主植物体内，与寄主植物及周围的环境形成复杂和谐的互利共生体系，其分布存在特异性，可以产生与寄主植物相似的代谢产物，也可以独立产生代谢产物，并赋予宿主植物抵抗生物、非生物的胁迫作用［3⁃4］。

三七Panax notoginsengBurk.F.H.Chen 为五加科植物，其干燥根及根茎入药，具有散瘀止血、消肿定痛的功效［5］，现代研究表明三七主要含有三七素、糖类、皂苷类、黄酮类、挥发油和氨基酸等成分。目前已从多株三七内生真菌中分离得到结构新颖的聚酮类以及N⁃苯甲酰氨基酸类化合物，其中聚酮苷类化合物具有抗肿瘤、抗病毒活性［6⁃8］，新的N⁃苯甲酰氨基酸类化合物对三七致病真菌显示一定的抗真菌活性［9］。有研究报道从三七内生真菌Cladosporium sp.的液体培养提取物中分离得到吡咯烷⁃二酮类化合物［10］，显示有轻微的抗甲型H1N1 流感病毒活性。本研究对三七内生真菌Cladosporium sp.化学成分进行研究，以期在其固体发酵产物中发现结构新颖且活性显著的次生代谢产物。

1 材料

德国Bruker 600 MHz 超导核磁共振波谱仪（德国Bruker 公司）；1260 高效效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；NP700C 半制备高效液相色谱仪（江苏汉邦科技有限公司）；EYELA 旋转蒸发仪（埃朗科技国际贸易有限公司）；LDZX⁃75KBS 高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；SW⁃CJ⁃2FBC超净工作台 （苏州智净净化仪器有限公司）；HNY⁃211B 恒温摇床（天津欧诺仪器股份有限公司）；恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）。葡聚糖凝胶Sephadex LH⁃20 （瑞典Ge Healthcare 公司）；硅胶材料和薄层层析板（青岛海洋化工有限公司）；制备薄层层析硅胶板（烟台江友硅胶开发有限公司）。

石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等有机试剂（成都市科隆化学品有限公司）；丙酮（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（色谱级，美国Fisher Scientific 公司）；氘代甲醇、氘代氯仿（美国Cambridge Isotope Laboratories 公司）。

三七内生真菌Cladosporium sp.，菌种由中南民族大学药学院杨小龙教授实验室提供并鉴定。将菌株Cladosporium sp.接种至PDA （马铃薯葡萄糖琼脂培养基） 上，于28 ℃恒温培养箱中培养3～5 d，然后将0.5 cm×0.5 cm 的菌块接种到PDB （马铃薯葡萄糖液体培养基） 中，以28 ℃，160 r／min 的培养条件培养5 d，作种子液备用。分别将每10 mL 种子液接种到盛有经灭菌后的100 g 大米＋100 mL MEB （麦芽糖浸粉肉汤固体培养基，内含蔗糖20 g／L、麦芽提取物20 g／L、蛋白胨1 g／L）中，恒温静置发酵培养35 d。

2 提取与分离

用甲醇⁃二氯甲烷（1 ∶1） 室温浸泡固体发酵物3 d，期间超声提取3 次，提取液经减压浓缩回收溶剂得浸膏。按体积比1 ∶1 加水后加入2 倍量的乙酸乙酯进行萃取3 次，得乙酸乙酯浸膏80 g。

用二氯甲烷／甲醇（100 ∶1～0 ∶1） 对浸膏进行柱层析梯度洗脱，得9 个组分Fr.1⁃9。Fr.2 经硅胶柱层析纯化得到Fr.2.1、Fr.2.2 和Fr.2.3 3个亚组分，Fr.2.1 析出化合物1 （35 mg）；Fr.2.2 再经硅胶柱层析和Sephadex LH⁃20 凝胶柱层析得到化合物2 （11.3 mg）、3 （34.7 mg）、4（18 mg）；Fr.3 经硅胶柱层析、Sephadex LH⁃20 凝胶柱层析和半制备HPLC 分别得到化合物5（3.3 mg）、6 （3.5 mg）；Fr.5 经硅胶柱层析后再经 Sephadex LH⁃20 凝胶柱层析得化合物 7（9.4 mg）；Fr.6 经薄层制备、Sephadex LH⁃20 凝胶柱层析得化合物8 （4.5 mg）、9 （7 mg）；Fr.8经硅胶柱层析得到化合物10 （4 mg）。

3 结构鉴定

化合物1： 无色晶体，分子式C28H44O，EI⁃MSm／z： 396.2 ［M］＋。1H⁃NMR （600 MHz，CDC13）δ：5.77 （1H，dd，J＝2.5，5.5 Hz，H⁃6），5.39 （1H，m，H⁃7），5.21 （2H，m，H⁃22，H⁃23），3.64 （1H，m，H⁃3）；13C⁃NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 141.4（C⁃5），139.8 （C⁃8），135.5 （C⁃23），131.9 （C⁃22），119.6 （C⁃6），116.2 （C⁃7），70.4 （C⁃3），55.7 （C⁃17），54.5 （C⁃14），46.2 （C⁃9），42.8 （C⁃13，C⁃24），40.7 （C⁃4），40.4 （C⁃16，C⁃20），39.0（C⁃1），38.4 （C⁃10），33.1 （C⁃25），31.9 （C⁃2），23.0 （C⁃15），21.1 （C⁃11，C⁃27），19.9 （C⁃21，C⁃26），19.6 （C⁃12），17.6 （C⁃28），16.3 （C⁃19），12.0 （C⁃18）。以上数据与文献［11］ 一致，故鉴定为3β ⁃羟基⁃麦角甾⁃5，7，22⁃三烯。

化合物2： 无色晶体，分子式C28H44O3，EI⁃MSm／z：428.1 ［M］＋。1H⁃NMR （600 MHz，CDC13）δ： 6.48 （1H，d，J＝8.3 Hz，H⁃7），6.22 （1H，d，J＝8.3 Hz，H⁃6），5.20 （1H，dd，J＝7.5，15.2 Hz，H⁃23），5.10 （1H，dd，J＝7.5，15.2 Hz，H⁃22），3.95 （1H，m，H⁃3）；13C⁃NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 135.4 （C⁃6），135.2 （C⁃7），132.3 （C⁃23），130.7 （C⁃22），82.1 （C⁃5），79.4 （C⁃8），66.4 （C⁃3），56.1 （C⁃17），51.6 （C⁃14），51.0 （C⁃9），44.5（C⁃13），42.7 （C⁃24），39.7 （C⁃20），39.3 （C⁃12），36.9 （C⁃4），34.6 （C⁃1），33.0 （C⁃25），30.1（C⁃2），28.6 （C⁃16），23.4 （C⁃11），20.9 （C⁃21），20.6 （C⁃15），19.9 （C⁃26），19.6 （C⁃27），18.2（C⁃19），17.5 （C⁃28），12.8 （C⁃18）。以上数据与文献［12］ 一致，故鉴定为3β⁃羟基⁃5α，8α⁃过氧化麦角甾⁃6，22⁃二烯。

化合物3： 无色油状，分子式C18H32O2，EI⁃MSm／z： 280.2 ［M］＋。1H⁃NMR （600 MHz，CDCl3）δ： 5.45 （4H，m，H⁃9，10，12，13），2.79 （2H，m），2.36 （2H，t，J＝7.2 Hz，H⁃2），2.05 （2H，m，H⁃14），2.10 （2H，m，H⁃8）；13C⁃NMR （151 MHz，CDCl3）δ： 180.0 （C⁃1），130.2 （C⁃13），130.0 （C⁃9），128.0 （C⁃10），127.9 （C⁃12），34.1 （C⁃2），31.5 （C⁃16），29.6 （C⁃7），29.3 （C⁃15），29.2 （C⁃4），29.2 （C⁃5），29.1 （C⁃6），27.2 （C⁃8），27.2（C⁃14），25.7 （C⁃11），25.5 （C⁃3），22.6 （C⁃17），14.1 （C⁃18）。以上数据与文献［13］ 一致，故鉴定为亚油酸。

化合物4： 无色针晶，分子式C28H40O，EI⁃MSm／z： 392.3 ［M］＋。1H⁃NMR （600 MHz，CDCl3）δ：6.61 （1H，d，J＝9.2 Hz，H⁃6），6.03 （1H，d，J＝9.5 Hz，H⁃7），5.74 （1H，s，H⁃4），5.26 （1H，dt，J＝7.7，15.1 Hz，H⁃22），5.21 （1H，dt，J＝9.1，15.1 Hz，H⁃23），1.70 （1H，m，H⁃11a），1.61（1H，m，H⁃11b），1.50 （1H，m，H⁃16b），1.49（1H，t，J＝5.9 Hz，H⁃25），1.29 （2H，m，H⁃12），1.26 （1H，m，H⁃17），1.06 （3H，d，J＝6.1 Hz，H⁃21），1.00 （3H，s，H⁃19），0.97 （3H，s，H⁃18），0.94 （3H，d，J＝7.0 Hz，H⁃28），0.88 （3H，d，J＝6.3 Hz，H⁃27），0.85 （3H，d，J＝6.3 Hz，H⁃26）；13C⁃NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 199.6 （C⁃3），164.4 C⁃5），156.1 （C⁃14），135.0 （C⁃22），134.0 （C⁃7），132.5 （C⁃23），124.4 （C⁃8），122.9（C⁃4），55.6 （C⁃17），44.2 （C⁃9），44.0 （C⁃13），42.8 （C⁃24），39.3 （C⁃20），36.7 （C⁃10），35.5（C⁃12），34.1 （C⁃2），33.1 （C⁃25），27.7 （C⁃16），25.3 （C⁃15），21.2 （C⁃21），20.0 （C⁃26），19.6（C⁃27），18.9 （C⁃18），17.6 （C⁃28），16.6 （C⁃19）。以上数据与文献［14］ 一致，故鉴定为麦角甾⁃4，6，8 （14），22⁃四烯⁃3⁃酮。

化合物5： 无色片状晶体，分子式C9H8O2，FAB⁃⁃MSm／z： 147.2 ［M⁃H］⁃。1H⁃NMR （600 MHz，CH3OD）δ： 7.69 （1H，s，J＝16.0 Hz，H⁃7），7.59（2H，m，J＝6.5，3.0 Hz，H⁃2，6），7.41 （1H，m，H⁃4），7.40 （2H，d，J＝3.6 Hz，H⁃3，5），6.49（1H，d，J＝16.0 Hz，H⁃8）；13C⁃NMR （150 MHz，CH3OD）δ： 170.4 （C⁃9），146.3 （C⁃7），135.8 （C⁃1），131.4 （C⁃4），130.0 （C⁃3，C⁃5），129.2 （C⁃2，C⁃6），119.4 （C⁃8）。以上数据与文献［15］ 一致，故鉴定为肉桂酸。

化合物6： 白色粉末，分子式C16H14O6，EI⁃MSm／z： 302.2 ［M］＋。1H⁃NMR （600 MHz，CDCl3）δ： 11.87 （1H，s，H⁃18），7.28 （1H，d，J＝2.0 Hz，H⁃8），6.72 （1H，s，H⁃3），6.56 （1H，d，J＝2.0 Hz，1⁃H），3.98 （3H，s，CH3⁃15），3.92 （3H，s，CH3⁃19），2.78 （3H，s，CH3⁃17）；13C⁃NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 166.6 （C⁃6），165.4 （C⁃11），164.7 （C⁃13），147.0 （C⁃2），140.0 （C⁃8），138.2（C⁃10），131.8 （C⁃7），127.4 （C⁃4），112.4 （C⁃12），111.4 （C⁃9），105.3 （C⁃5），99.3 （C⁃3），99.2 （C⁃1），56.4 （C⁃19），55.9 （C⁃15），25.6 （C⁃17）。以上数据与文献［16］ 一致，故鉴定为3，10⁃二羟基⁃4，8⁃二甲氧基⁃6⁃甲基苯甲香豆素。

化合物7： 白色粉末，分子式C9H8O3，FAB-⁃MSm／z： 163.1 ［M⁃H］⁃。1H⁃NMR （600 MHz，CH3OD）δ： 7.61 （1H，d，J＝16.0 Hz，H⁃7），7.44（2H，d，J＝8.5 Hz，H⁃2，6），6.82 （2H，d，J＝8.5 Hz，H⁃3，5），6.28 （1H，d，J＝16.0 Hz，H⁃8）；13C⁃NMR （150 MHz，CH3OD）δ： 171.0 （C⁃9），161.2 （C⁃4），146.6 （C⁃7），131.1 （C⁃2，C⁃6），127.2 （C⁃1），116.8 （C⁃3，C⁃5），115.6 （C⁃8）。以上数据与文献 ［17］ 一致，故鉴定为对p⁃香豆酸。

化合物8： 无色油状，分子式C6H12O4，EI⁃MSm／z： 130.3 ［M］＋。1H⁃NMR （600 MHz，CDCl3）δ：4.54 （1H，ddd，J＝11.2，8.4，6.5 Hz，H⁃5a），4.28 （1H，dt，J＝11.2，4.6 Hz，H⁃5b），2.60（1H，d，J＝17.5 Hz，H⁃2a），2.43 （1H，d，J＝17.5 Hz，H⁃2b），1.84 （2H，dd，J＝7.5，5.0 Hz，H⁃4a，4b），1.31 （3H，s，CH3⁃6）；13C⁃NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 171.3 （C⁃1），67.7 （C⁃3），66.2（C⁃5），44.4 （C⁃2），35.5 （C⁃4），29.3 （C⁃6）。以上数据与文献［18］ 一致，故鉴定为R⁃甲瓦龙酸内酯。

化合物9： 白色粉末，分子式C10H8N2O2，EI⁃MSm／z： 188.2 ［M］＋。1H⁃NMR （600 MHz，CH3OD）δ： 8.73 （1H，s，H⁃2），8.32～8.29 （1H，m，H⁃4），7.49～7.47 （1H，m，H⁃7），7.27 （1H，dd，J＝6.0，1.1 Hz，），7.25 （1H，m，J＝6.0，1.1 Hz，）；13C⁃NMR （151 MHz，CH3OD）δ： 183.1 （C⁃8），168.2 （C⁃9），139.4 （C⁃2），138.0 （C⁃7a），127.9 （C⁃3a），124.8 （C⁃6），123.8 （C⁃5），123.0（C⁃4），114.0 （C⁃7），113.1 （C⁃3）。以上数据与文献［19］ 一致，故鉴定为（1H⁃indol⁃3⁃yl） ⁃oxoac⁃etamide。

化合物10： 浅黄色油状，分子式C18H32O4，EI⁃MSm／z： 312.1 ［M］＋。1H⁃NMR （600 MHz，CDCl3）δ：5.59 （1H，dt，J＝11.0，7.6 Hz，H⁃10），5.46～5.35 （2H，m，H⁃14，H⁃9），5.30 （1H，ddd，J＝6.1，5.2，4.4 Hz，H⁃13），4.27～4.16 （1H，m，H⁃8），3.45 （2H，dd，J＝11.0，5.0 Hz，H⁃7），2.93～2.78 （2H，m，H⁃11 H⁃12），2.34 （2H，t，J＝7.3 Hz，H⁃2），2.04 （2H，dd，J＝14.6，7.3 Hz，H⁃15），1.54～1.14 （18H，m）；13C⁃NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 178.8 （C⁃1），133.3 （C⁃10），131.2 （C⁃13），128.5 （C⁃9），126.5 （C⁃12），74.8（C⁃7），71.1 （C⁃8），33.9 （C⁃2），32.4 （C⁃6），31.5 （C⁃16），29.7 （C⁃15），29.2 （C⁃4），28.9 （C⁃14），26.3 （C⁃11），25.2 （C⁃15），24.5 （C⁃3），22.6 （C⁃17），14.1 （C⁃18）。以上数据与文献［20］ 一致，故鉴定为7，8⁃dihydroxy⁃9，12 （Z，Z） ⁃octadecadienoic acid。

4 讨论

本实验从三七内生真菌Cladosporium sp.大米固体发酵产物中分离并鉴定了10 个化合物，含有脂肪酸类、麦角甾类、香豆素类、酚酸类和吲哚类，其中化合物5～9 均为首次从该内生真菌中分离得到；化合物5 是重要的化工原料，合成药物的中间体；化合物7 具有抗氧化、抗肿瘤、保护心血管及神经保护作用［21］；化合物8 有助于修复受损的角质层，具有良好的抗衰老功能，是各类护肤品的重要成分之一。另外，本实验没有分离获得到文献报道的同属来源真菌中所得的大环内酯类［22］、聚酮类［23］化合物，其原因可能是菌种来源和培养条件的差异影响了内生真菌基因的表达，进而影响其次生代谢产物种类。因此，在内生菌次级代谢产物的研究中，可以通过改变培养条件以及表观遗传修饰等手段进行优化发酵过程，以期得到更多有活性的新化合物。