吴心虹，李泰标，廖秋菊，何毅琪，林友益

福建省厦门市第五医院中医科(厦门 361101)

中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(Neutrophil gelatinase-aussociated lipocalin，NGAL)是脂笼蛋白(lipocalin)家族的新成员。笔者在前期通过对非透析肾性贫血患者进行临床观察[1]，证实NGAL介导的铁代谢途径对慢性肾脏病与贫血具有重要作用。血NGAL与尿NGAL对肾性贫血铁代谢的诊断更有临床应用价值，可能是反应铁代谢的新型指标。血NGAL主要反应肾功能下降和贫血程度，而尿NGAL是血NGAL升高的结果，亦反应了肾小管的损伤情况，故血清NGAL可能是肾性贫血的潜在作用点。Kim等[2]通过临床观察亦证实血浆NGAL水平与慢性肾病患者透析前贫血的铁状态相关。

补肾养血祛浊中药在临床上治疗肾性贫血取得较好的疗效，联合促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)治疗更有利于肾性贫血的纠正。然而研究多围绕疗效观察进行，具体机制研究文献报道较少，分子生物依据少。本研究通过补肾养血祛浊方干预肾性贫血大鼠，观察Scr、Hb、Fer、TAST改变，实时荧光定量 PCR (Real time，PCR) 检测肾组织NGAL、EPOR水平，Western blot 检测肾组织 NGAL及EPOR蛋白水平，从而阐述中药纠正肾性贫血的作用机理。

材料与方法

1 材 料

1.1 实验动物：健康SPF级 SD雄性大鼠共70只(体重180～220 g)，由厦门大学实验动物中心提供(许可证号：SYXK(闽)2013-0006)。

1.2 主要试剂：RNA提取试剂盒(Promega)；逆转录试剂盒(Promega)；SYBR®Green Realtime PCR Master Mix试剂盒(TOYOBO)；NGAL ELISA试剂盒(Abcom)；EPO ELISA试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；EPOR ELISA试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；铁蛋白ELISA试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；兔抗大鼠NGAL、EPOR多克隆抗体(Proteintech)；蛋白提取试剂盒(Promega)。

2 研究方法

2.1 实验分组：将75只健康的SPF级大鼠，运用标准大鼠饲料适应性喂养1周后，随机分为5组，即正常组(N组)25只、模型组(M组)25只、中药组(Z组)25只。

2.2 模型建立及动物处理

2.2.1 造模：参照相关文献[3]，将1.5%腺嘌呤混悬液，以腺嘌呤300 mg/(kg·d)灌胃，共6周，正常组以等容量蒸馏水灌胃。造模期间15只大鼠死亡。造模6周后，随机选取4只大鼠，眼眶取血，检测Hb、Scr、BUN，证实造模成功。

2.2.2 本方组成：淫羊藿、鹿角胶、熟地黄、当归、黄芪、茯苓、大黄、补骨脂、鸡血藤等组成，生药制成浓缩汤剂。中药制法：①称取生药255 g，用水浸泡30 min，煮沸后再煎30min，过滤；②得滤渣,加水，加热(二煎)至沸腾后，再煎20 min，再过滤。每天上午灌胃给药，用量均按临床上成人每公斤体重用量的 6倍换算，予5 ml/(kg·d)灌胃；模型组予灌生理盐水10 ml/(kg·d)，给药时间为4周。

2.2.3 动物处理：采用10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，开腹开胸后，取肾脏，处死前腹主动脉采血3 ml；左肾以多聚甲醛固定，梯度脱水、透明，进行石蜡包埋，制作石蜡切片，用于免疫组化检测；右肾用消毒锡箔纸包好速冻于液氮中，后转至-80°C 冰箱保存，用于实时荧光定量 PCR 及 Western blot检测。

3 指标检测

3.1 常规实验室法检测血清Hb、Scr、BUN、Fe、总铁结合力(TIBC)、血清铁(SI)水平，TAST由TIBC、SI计算得出。

3.2 ELISA法检测血清Fer、EPO、NGAL含量，操作步骤严格按照试剂盒说明书执行。

3.3 实时荧光定量PCR检测肾组织NGAL mRNA、EPOR mRNA表达变化：取肾组织依照TRIzol(invitrogen)法提取总RNA，逆转录为cDNA，使用SYBR®Green Realtime PCR Master Mix试剂盒(TOYOBO)以7500Software进行荧光扩增，检测基因序列详见表1，GAPDH作为内参照;以正常组 mRNA 的表达量作为“1”，再根据校正值计算出模型组及中药组mRNA相对含量，进行比较。见表1。

3.4 Western blot 检测肾组织NGAL、EPOR蛋白表达：组织称重，按比例加入相应裂解液，匀浆离心，抽取上清，BCA 法测定蛋白浓度。加入buffer，100°C 使蛋白变性利于保存。电泳分离，切胶，转膜，5% 脱脂奶粉室温封闭1h，加入1∶1000一抗(NGAL、EPOR，Proteintech公司)，4°C摇床孵育过夜，次日TBST洗涤后，加入过氧化氢物酶标记的二抗，室温摇床孵育1 h，TBST洗膜3次后，使用化学发光系统(ECL)检测标本膜上信号。

表1 检测基因引物序列和产物长度

结 果

1 各组大鼠血清指标比较 与正常组比较，模型组Hb、EPO均明显降低(P<0.01)，TAST降低(P<0.05)，NGAL水平升高(P<0.05)，Scr、BUN、Fer均明显升高(P<0.01)。与模型组比较，中药组Hb、TAST、EPO水平明显升高(P<0.01)，Scr、NGAL水平明显降低(P<0.01)，Fer、BUN水平均明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清指标表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05，△P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，▲P<0.01

2 各组大鼠PCR表达情况 与正常组比，模型组肾脏NGAL mRNA明显升高(P<0.01)，EPOR mRNA明显降低(P<0.01)，中药组肾脏NGAL mRNA升高(P<0.05)，EPOR mRNA升高(P<0.05)；与模型组比较，中药组肾脏NGAL mRNA减少(P<0.05)，EPOR mRNA明显升高(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠PCR表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05，△P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，▲P<0.01

3 各组大鼠Western blot检测水平 模型组较正常组肾脏NGAL 蛋白水平升高(P<0.05)，中药组较模型组肾脏NGAL 蛋白水平减少(P<0.05)；模型组较正常组EPOR蛋白水平降低(P<0.05)，中药组较模型组EPOR蛋白水平明显升高(P<0.01)。见表4及图1-2。

表4 各组大鼠各蛋白表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05，▲P<0.01

讨 论

CKD发生的贫血是由于促红细胞生成素和铁缺乏、慢性炎症、继发性甲状旁腺功能亢进和红细胞缩短半衰期[4-5]。铁缺乏是CKD患者贫血的第二大原因，首要原因是促红细胞生成素缺乏。EPO 是红细胞生成的主要调控因子，通过和EPOR 结合发挥其促进红系祖细胞的增殖、分化与成熟的生物学效应[6-7]。在本实验中，模型组大鼠血清中Scr、BUN、Fer升高，Hb、血清EPO及肾脏EPOR水平降低，肾性贫血模型成立，但在造模过程中，大鼠死亡15只，考虑与该造模方法腺嘌呤用量较大有关。

NGAL是一个25kDa的中性粒细胞明胶酶单体，循环的NGAL可透过肾小球滤过膜。NGAL与肾脏病关系的相关研究报道已有不少，其水平与肾损害程度相关[8-9]，而NGAL亦参与贫血的发生发展，早期研究认为NGAL可通过Tf转铁途径参与慢性病贫血[10]，随着研究的进展，人们通过体外实验发现NGAL

也是调节红细胞生长机制的重要因素[11-12]。我们前期研究[1]，观察透析前CKD贫血患者NGAL与铁状态指数之间的关系，结果支持血浆NGAL与CKD贫血患者的铁状态有关，与Fer、TAST呈正相关，且特异性及敏感性均高于Fer。本实验中，模型组血浆及肾脏NGAL均升高，故考虑血浆NGAL升高与肾脏NGAL升高有关。

肾性贫血有关的病名如“虚劳”、“肾劳”、“血虚”等病名[13]。历代医家多认为本病病机为：肾精亏虚，脾气衰惫，后天无以滋养先天，脾肾俱虚，气血生化不足，浊邪内蕴，瘀血阻滞，可将其概括为正虚邪实。《张氏医通》曰“血之源头在乎肾”而《侣山堂类辨》云“肾为水脏，主藏精而化血”。肾藏精，肾虚精亏，精不生血，则致血虚。《宣明论方》谓：“湿气先伤人之阳气，阳气伤不能调通水道，亦使人真阴不能生长而耗阴液。”津血同源，阴液耗则阴血生化乏源。治疗多以补肾填精，健脾益气，养血泻浊为主。本方以补肾养血泻浊法为主，选用淫羊藿、阿胶、熟地黄、当归、黄芪、茯苓、大黄等药物组成方。方中药物有以下特点：淫羊藿温肾阳而不燥；淫羊藿、阿胶配合使用，意在阴中求阳，阳中生阴，阴阳生化无穷，以期阴平阳秘、肾元充裕之功。熟地黄味甘微温质润，既补血滋阴，又能补精益髓；当归多糖能提高动物白细胞和网织红细胞水平，促进红细胞及血红蛋白的生成，疗效优于铁剂。黄芪、茯苓健脾益气升清、补后天以助先天，生化有源，佐以大黄通腑降浊。全方共奏益精补血之功，更添温肾降浊之效，对肾性贫血有好的治疗作用。

包晓星等[14]运用健脾益肾泻浊方配合EPO治疗肾性贫血，结果表明能有利于体内肌酐、尿素氮等代谢产物的排除，减少毒素对造血细胞的抑制和破坏，改善贫血程度。范军等[6]研究发现补肾生血方可通过提高骨髓有核细胞 EPOR mRNA 表达量达到治疗肾性贫血的作用。有许多实验证明[15]，中医药可通过降低NGAL水平减少相关炎症细胞因子表达、抑制炎症反应、减轻氧化应激、抗细胞凋亡、诱导细胞自噬、抗肾间质纤维化等方式减轻肾小管损伤、肾小球硬化，抑制肾小球系膜细胞的增殖，保护肾组织，然而未见对肾性贫血的治疗作用。本实验中，中药组较模型组Scr、BUN明显降低，Hb、血清EPO明显升高，说明补肾养血祛浊方对肾性贫血有治疗作用。同时，与模型组比较，中药组Fer降低，TAST升高，血清NGAL、肾脏NGAL mRNA及蛋白水平均降低，说明该方可降低NGAL水平，改善肾性贫血铁代谢情况。

实验表明，补肾养血祛浊方能降低血清及肾脏NGAL水平，改善铁代谢情况，从而保护肾功能，纠正肾性贫血。为进一步了解NGAL在肾性贫血中的变化意义，今后将从细胞分子水平进一步研究。