虞海燕 岑建萍 林晓霞 何剑萍 王瑶瑶 程浩

白癜风是一种获得性的以局部或全身多发色素脱失斑为特征的皮肤疾病。其毁损性的外观严重影响患者的生活质量。迄今，其病因及发病机制未明，为疾病的有效防治带来困难。多数学者认为白癜风是一种多基因遗传的自身免疫性疾病，在多种环境因子如氧化应激、神经精神和病毒等因素的激发下出现免疫功能紊乱，导致表皮黑素细胞破坏[1]。氧化应激损伤是目前认为导致黑素细胞功能损伤及黑素细胞丢失的一个重要因素[2]。现已知自噬有助于黑素细胞稳定自身的氧化还原稳态，保护细胞免受氧化损伤，是细胞维持自身稳态的一种重要机制。细胞可通过自噬清除损伤或多余的细胞器进行自我保护，并通过快速而相对简单的过程清除胞内微生物而参与免疫反应[3]。正常自噬功能有助于均衡免疫反应，从而防止疾病发生。自噬失衡可导致异常的免疫反应而产生疾病，研究已发现许多自身免疫性疾病存在自噬异常如红斑狼疮及炎症性肠病等。自噬的调节对黑素细胞的生理功能也有着重要影响，紫外线抵抗相关基因（ultroviolet radiation resistance associated gene，UVRAG） 能激活自噬相关基因BECN1的相关通路而促进自噬，其基因的多态性与白癜风有关，研究非节段性白癜风的患者发现UVRAG可能与白癜风的易感性有关[4]。另外,敲除自噬相关基因BECN1可导致黑素聚集的下降[5]。然而，自噬在白癜风发病中的作用尚未明了，本研究将利用原代体外黑素细胞培养的方法分离白癜风患者及正常对照的黑素细胞，采用免疫印迹法检测并比较自噬相关蛋白表达的差异，分析它们与疾病可能的相关性，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 原代培养的白癜风黑素细胞（白癜风组）从泛发型白癜风患者躯干皮损周围的正常皮肤组织中提取，所取的3例不同白癜风样本均来自于本院白癜风专科门诊的患者，由2位医生分别确定诊断归属于泛发型白癜风，并行伍德灯确定。排除标准：近3个月接受系统药物治疗及光疗，躯干部无皮损或躯干部的皮损近1个月使用外用药物治疗者。患者均签署知情同意书。正常的黑色素细胞（对照组）为来源于本院泌尿外科包皮环切手术3例患者所废弃的皮肤组织。

1.2 方法

1.2.1 原代黑素细胞培养方法 皮肤组织去除皮下组织，经0.25%Dispase酶4℃共育过夜，分离表皮与真皮，用0.25%胰蛋白酶溶液消化表皮10min，用移液器轻轻吹打。细胞悬浮液经细胞过滤器过滤后1 000r/min离心10min，收获细胞。黑素细胞在加有100μg/ml选择抗生素G418（美国Gibco公司）的黑色素细胞培养液（美国Sciencell公司）中选择性生长。细胞孵育于37℃，5%CO2的培养箱中，2～4代的细胞用于实验检测。

1.2.2 自噬相关蛋白表达检测 采用免疫印迹法。取对数生长期不同来源的黑素细胞，制成细胞悬液，调整细胞密度为1×105/ml，接种于10 mm培养皿内，培养48h后，用蛋白裂解液裂解细胞，测定蛋白含量，用10%聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质分离，然后转移到聚乙二烯二氟化物膜，将膜移至含有封闭液5%的脱脂奶粉的平皿中室温封闭2h，然后分别与相应的抗微管相关蛋白轻链 3（microtubule-associated protein-1 light chain 3，LC3）抗体（美国Proteintech公司）、抗 p62抗体（美国Proteintech公司）、抗自噬相关基因5（autophagy related gene 5，Agt 5）抗体（英国 Abcam 公司）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR)抗体（英国Abcam公司）或抗β-actin抗体（美国Cell signalling Technology公司）共育过夜，用TBST缓冲液4℃摇床上洗涤4次，再与连接有辣根过氧化物酶的二抗共育4h。用ECL试剂盒对信号进行可视化。使用扫描密度分析图像软件对条带进行密度扫描。

1.2.3 酪氨酸酶活性测定 采用改良的多巴胺法[6]。调整培养黑素细胞的浓度为1×105/ml，将150ml接种于96孔板中。置于37℃，5%CO2培养箱中培养24h，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞2次，再于每孔加入50μl 1%Triton X-100/PBS裂解细胞，每孔加入100ml 1%L-DOPA置37℃孵育4h后，使用酶标仪测量吸光度。

1.4 统计学处理 采用Graphpad prism6统计软件，计量资料以表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞LC3Ⅱ/Ⅰ及p62蛋白表达比较 见图1。

图1 两组黑素细胞LC3Ⅱ/Ⅰ及p62蛋白表达（a：蛋白表达电泳图；b：灰度分析图，与对照组比较，**P＜0.01）

由图1可见，白癜风组LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达值为2.71±0.08，显著高于对照组 1.01±0.18，白癜风组 p62 蛋白表达值为 0.45±0.03，显著低于对照组 0.71±0.08，差异均有统计学意义（t=10.36、5.12，均 P＜0.01）。

2.2 两组细胞Atg5和mTOR蛋白表达比较 见图2。

由图2可见，白癜风组Atg5蛋白表达值为0.74±0.03，显著高于对照组 0.49±0.02，白癜风组 mTOR 蛋白表达值为 0.23±0.02，显著低于对照组 0.39±0.04，差异均有统计学意义（t=13.01、7.22，均 P＜0.01）。

2.3 两组细胞酪氨酸酶活性比较 白癜风组酪氨酸酶活性为 0.646±0.002，明显低于对照组 0.784±0.006（t=36.51，P＜0.01)。

图2 两组黑素细胞Atg5和mTOR表达（a：蛋白表达电泳图；b：灰度分析图，与对照组比较，**P＜0.01）

3 讨论

自噬是维持细胞内稳态的一个重要途径，也是细胞清除自身破损细胞器和降解长寿蛋白必不可少的一个方式[3]，自噬的调节对黑素细胞的生理功能有着重要的影响。本研究结果显示，白癜风患者皮损旁的黑素细胞在体外培养时自噬标志物LC3Ⅱ/Ⅰ上调、p62蛋白表达降低。LC3是可靠的自噬标志物[7]，它有两种存在形式LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，当发生自噬时，部分LC3Ⅰ型转化为LC3Ⅱ型，LC3Ⅱ含量或 LC3Ⅱ和 LC3Ⅰ比值与自噬活性呈正相关。在自噬过程中，与之结合的适配器蛋白p62/SQSTM1被消耗，因此，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的增高伴随p62蛋白的下降提示有自噬的增高。本研究结果提示，体外培养的白癜风皮损旁黑素细胞存在有自噬功能的活化。另外，Atg5是自噬体形成过程中所需的一种关键蛋白，在自噬囊泡的形成过程中，Atg12联合Atg5然后与Atg16结合构成Atg12-Atg5-Atg16复合体而附集于膜上辅助自噬囊泡的形成，而mTOR是自噬的一个重要调节蛋白，它可以通过磷酸化使UNC-51样酶失活而抑制自噬，因此，自噬通路的活化常常伴随Atg5蛋白的表达增高及mTOR蛋白的下调。本实验结果显示,白癜风黑素细胞自噬相关蛋白Atg 5的表达升高、mTOR蛋白表达降低，提示白癜风患者皮损旁的黑素细胞在体外培养时具有自噬通路的活化。

自噬的调节对于黑素细胞黑素的形成具有双向调节作用[8]。用雷帕霉素诱导自噬可以显著增加黑色素指数、酪氨酸酶活性以及与黑素体生物合成相关的几种蛋白的表达，用siRNA抑制并下调LC3可以降低黑色素含量和酪氨酸酶活性[9]。敲除自噬相关基因BECN1可导致黑素含量及黑素颗粒的数量下降[5]。提示促进自噬可以增加黑素细胞合成黑素的功能。然而，与之相反，一种公认的黑素抑制剂白藜芦醇是通过诱导自噬而抑制黑素刺激素所诱导的黑素合成，而敲除ATG5可显著抑制白藜芦醇介导的抗黑素生成以及其诱导的自噬[10]。波长为585nm的发光二极管（light-emitting diode，LED）光调能通过诱导黑素细胞的自噬而抑制黑色素生成，并与光的剂量呈剂量依赖性[11]。此外，抑制黑素小体在细胞内的转运也可以诱导自噬并降解黑素，以茶碱作用于黑素细胞或下调黑素体运输的蛋白质的表达，可观察到酪氨酸酶表达水平显著下降，以及LC3Ⅱ表达增高和p62表达下降[12]。白癜风患者皮损旁的黑素细胞所显示的自噬标记物LC3Ⅱ高表达，底物p62低表达以及酪氨酸酶活性的下降，提示白癜风皮损旁的黑素细胞自噬激活可能与其黑素合成功能的下降有关。

现有的证据表明自噬有助于黑素细胞稳定自身的氧化还原稳态，保护细胞免受氧化损伤，自噬缺陷的黑素细胞对于紫外线照射后产生的氧化损伤以及黑素细胞的早衰起着一定作用[13]，Atg7缺失的黑素细胞显示有明显的生长停滞、氧化损伤和多功能适配蛋白p62的堆积[13]。在白癜风的发病中，氧化应激损伤可能是导致黑素细胞功能损伤及黑素细胞丢失的一个重要因素[2]，氧化应激所产生的活性氧和活性氮是维持自噬的主要细胞内信号转导因子[14]。因此，我们推测本研究所显示的体外培养白癜风黑素细胞所呈现的自噬增高可能是黑素细胞稳定自身氧化还原平衡，保护细胞免受氧化损伤的一种自身保护机制。自噬在白癜风发病中的作用可能与黑素细胞氧化还原平衡破坏有关[15]。但其详细机制还需进一步的研究阐明。

综上所述，来自于泛发型白癜风皮损旁的黑素细胞呈现有自噬通路的激活同时伴有黑素形成所需的酪氨酸酶活性降低，提示黑素细胞中自噬的活化可能与黑素细胞功能异常及白癜风的发病有关，推测自噬的增高可能是机体对于氧化还原失衡的一种自身保护机制。基于本研究的样本量较少，需进一步扩大样本量研究证实，同时自噬在白癜风发病中的具体作用也需进一步的研究阐明。