陈忠信 郝泽坤 孙 一 虞亚菲 岳宗扬 焦凤萍

山东第一医科大学(山东省医学科学院)公共卫生学院，山东 泰安 271016

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的基因突变与原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发生发展密切相关[1]，HBV的基因突变是HCC发生发展的重要病毒学因素，因此，筛选与HCC发生发展相关的HBV突变对HCC患者的诊断和预防有一定的临床用途。

HBV为不完全闭合环状双链DNA，大小为3215 bp，其基因组虽小，但结构十分精巧，包括有4个相互重叠的开放阅读框、4个启动子和2个增强子[2]。HBV- T3098C突变正位于HBV基因组的Promotor II和preS1的重叠区域，并且可以使preS1蛋白的第84位氨基酸发生改变，使异亮氨酸(Ile)变为苏氨酸(Thr)。在本研究中，我们检测23例HCC患者癌组织中T3098C突变的情况，与患者的临床资料进行分析，寻找临床相关性，并采用细胞学实验来检测T3098C突变对HBsAg合成和分泌的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1研究对象 HCC患者术后病理检查的残余的癌组织。

1.1.2主要试剂 2×PCR反应试剂盒、FastPfu高保真酶试剂盒、BioLabs的DpnI酶和TaKaRa的PrimeSTAR聚合酶均购自北京全式金生物技术有限公司；蛋白酶K溶液、DNA提取试剂盒(Axygen)、HBsAg时间分辨荧光检测试剂盒、琼脂糖等购自泰安华鹏试剂公司。

1.2 方法

1.2.1标本采集 23例HCC患者术后病理检查剩余的标本，在-70℃冰箱冷冻保存。

1.2.2DNA提取和滚环扩增HBV cccDNA 按照Axygen DNA试剂盒说明书的操作步骤提取癌组织的DNA，并采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；采用PSAD酶消化非共价闭合环状DNA，滚环扩增方法参照文献。

1.2.3PCR扩增HBV cccDNA的preS区并测序 PCR法扩增HBV cccDNA的preS区，扩增引物参见文献[2]。琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中目的条带，送公司测序，测序结果采用DNAStar软件进行分析和比对，寻找HBV C基因型T3098C突变位点在23例HCC患者术后的癌组织中的存在情况。……