陈 露，朱伟峰，魏后军，仇汝龙，胡 波，范志宇，陈萌萌，王 芳

（1.江苏省农业科学院兽医研究所，南京 210014；2.农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室，南京210014；3.国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京 210014）

多杀性巴氏杆菌可引起多种畜禽和野生动物的巴氏杆菌病[1-2]，因发病程度和感染动物不同而有不同的病名，如猪肺疫、猪进行性萎缩性鼻炎、禽霍乱、牛出血性败血症、兔出血性败血症等。近年来多杀性巴氏杆菌在多种动物中的临床分离率或检出率均位居细菌性病原的前列[3-5]，给养殖业造成了巨大的经济损失。多杀性巴氏杆菌同样可以造成人类感染发病，是一种人兽共患病病原体。与动物密切接触的人群的血清中巴氏杆菌抗体阳性率比未接触者高两倍左右[6]。人类发病主要通过伤口感染。患者创口处肿胀、剧痛、发热、形成脓肿和周围淋巴结炎，个别病例出现败血症和脑膜炎[1-2]。目前，研究发现荚膜、脂多糖、外膜蛋白等毒力因子与多杀性巴氏杆菌的致病性有关[7]，但是尚不能完全清楚地解释巴氏杆菌病发病的分子机制，也无法完全确定各毒力因子在致病中的作用[8-9]。

孔蛋白OmpH是多杀性巴氏杆菌的一种主要的外膜蛋白[10]。在多杀性巴氏杆菌的全基因组序列中，存在两个拷贝的OmpH基因（间隔154 bp），分别编码蛋白质OmpH1和OmpH2[11]。过去对OmpH1（通常称为OmpH）的研究较多，现有研究表明OmpH是保护性抗原并具有黏附作用[12-13]。很多病原菌的黏附因子除了可以黏附宿主细胞外还可以黏附胞外基质成分（如纤维连接蛋白，Fibronectin，Fn）或者通过结合宿主血浆纤维蛋白溶解酶原（Plasminogen，Plg）促进细菌对宿主细胞和组织的黏附[14-15]。已经有学者通过招募实验证实多杀性巴氏杆菌能够利用Fn和Plg[16-17]。目前关于OmpH2的致病作用的报道较少，仅少量研究表明其与康复血清间存在反应[18]。OmpH2作为多杀性巴氏杆菌一种与OmpH1同源的外膜蛋白，可能也是一个黏附因子。OmpH2是否通过结合宿主Fn和Plg促进多杀性巴氏杆菌对宿主的黏附的研究具有重要意义。本文旨在通过研究OmpH2对Fn和Plg的黏附作用，从而初步揭示多杀性巴氏杆菌OmpH2分子致病机制。

1 材料和方法

1.1 质粒、菌种及培养pET28a（+）表达载体、BL21（DE3）宿主菌、多杀性巴氏杆菌C51-17株为本试验室保存。多杀性巴氏杆菌使用马丁肉汤（海博，青岛）添加10% 新生牛血清（Gibco）培养。大肠杆菌使用（LB）（海博，青岛）液体或固体培养基培养。

1.2 序列比对从PMTB2.1菌株全基因组序列[19]中找到OmpH1和OmpH2的基因序列并转码为氨基酸。然后使用Clustal Omega（http://www.clustal.org/omega/）进行多序列比对，比较OmpH1和OmpH2蛋白质一级结构之间的相似性和差异。

1.3 OmpH2基因的克隆以多杀性巴氏杆菌 PMTB2.1菌株OmpH2的基因序列[19]为参考序列，设计克隆引物。使用SignalIP4.0找出信号肽对应基因序列并截去，进而设计引物OmpH2-F（5'-cagcaaatgggtcgcg gatccGCAACCGTTTTCGATAAAGAAGG-3'，小写字母为与载体相同的同源臂，下同）和OmpH2-R（5'-gcaagcttgtcgacggagctcGAAGTGTACGCGTAAA CCAACACC-3'）。按照文献[20]提取C51-17菌株基因组并进行PCR扩增。酶切质粒并通过同源重组克隆试剂盒（诺唯赞，南京）将OmpH2的PCR扩增片段连接到pET28a（+）上，将阳性重组质粒转化BL21感受态细胞。经PCR鉴定后，将阳性克隆送南京擎科生物科技有限公司测序。

1.4 诱导表达并鉴定对OmpH2重组大肠杆菌进行IPTG诱导表达。优化诱导温度，分别设置为37℃、28℃、16℃；优化IPTG终浓度，分别设置为0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L。重组菌诱导表达后超声波破碎，12000×g离心，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析，检测表达效果。

1.5 rOmpH2与多杀性巴氏杆菌感染康复血清的反应将rOmpH2进行SDS-PAGE并将蛋白转到NC膜上，同时以红斑丹毒丝菌SpaA重组蛋白为阴性对照，多杀性巴氏杆菌GAPDH重组蛋白为阳性对照，对照组重组蛋白已经在以前的研究[15,17]中制备。经过5%的脱脂乳封闭后，加入本实验室保存的1/500稀释的C51-17株的兔感染康复血清[21]，37℃孵育1 h；PBST漂洗5遍，加入1/5000稀释的HRP偶联的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h； PBST漂洗5遍，进行ECL（诺唯赞，南京）显色。

1.6 Fn和Plg结合活性检测参照文献[15]进行Far Western blot实验。将重组rOmpH2进行SDS-PAGE并将蛋白转到NC膜上。经过5%脱脂乳封闭后，加入10 μg/mL人源Fn或 Plg（Sigma），37℃孵育2 h。对照组不与Fn及Plg进行孵育，但同样进行后续操作。漂洗5遍，分别加入1/1000稀释的兔抗人纤维连接蛋白抗体和兔抗人血浆纤维蛋白溶解酶原抗体，37℃孵育1 h。PBST漂洗5遍，加入1/5000稀释的HRP偶联的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；PBST漂洗5遍，进行ECL（诺唯赞，南京）显色。

1.7 rOmpH2多克隆抗体的制备将100 μg/50 μL纯化的重组蛋白rOmpH2用等体积弗氏完全佐剂（Sigma）乳化后，以腹腔注射方式免疫5只小鼠，每只100 μL，14 d后，以100 μg/ 50 μL纯化的重组蛋白同等体积弗氏不完全佐剂（Sigma）乳化后，采用皮下注射方式进行二次免疫。第二次免疫10 d后采血制备多克隆抗血清，并用蛋白A抗体纯化试剂盒（金斯瑞，南京）纯化出血清中的IgG。

1.8 Plg和Fn的招募抑制实验参照文献[22-23]进行实验。以多杀性巴氏杆菌C51-17株包被ELISA板，108CFU/孔，4℃过夜；经PBST洗涤3次，以5%脱脂乳37℃封闭1 h。以50 μL 1/10稀释的OmpH2 IgG 37℃孵育0.5 h，并以1/10稀释的免疫前血清IgG为对照，PBST洗涤3遍，分别与50 μL的纤维连接蛋白（100 ng）和血浆纤维蛋白溶解酶原（100 ng），37℃孵育1 h。洗涤后，每孔加入1/1000稀释的兔源抗血浆纤维蛋白溶解酶原IgG或者1/1000稀释的兔源抗纤维连接蛋白IgG，37℃孵育0.5 h；洗涤3次，加入1/5000稀释的HRP偶联的羊抗兔二抗，37℃孵育0.5 h。洗涤后，每孔加入100 μL TMB显色液，室温避光反应10 min后，加入终止反应液。在酶标仪上读取450 nm的吸光度。以OmpH2 IgG处理组的OD值除以免疫前血清IgG处理组的OD值计算多杀性巴氏杆菌对Fn和Plg的相对结合活性。实验重复3次，用t检验检测实验组和对照组的统计学差异。

2 结果

2.1 OmpH2和OmpH1的氨基酸序列比对结果对OmpH2和OmpH1的氨基酸序列进行比对，其序列一致性为46.1%，相似性为78.2%。但是两者存在若干高度相同或相似的局部区域（如OmpH2的L106～F148、L185～K204等），见图1。

2.2 OmpH2重组蛋白的表达和纯化将扩增的OmpH2的基因连接到pET28a（+）载体上，阳性菌株测序结果显示C51-17株的OmpH2基因序列与GenBank上PMTB2.1株OmpH2基因序列一致性为100%。将重组质粒转入BL21工程菌后，通过优化诱导条件，选用37℃、0.6 mmol/L IPTG诱导表达，获得较多的重组蛋白rOmpH2（～43 kDa），主要以包涵体形式表达（图2A）。

2.3 rOmpH2与多杀性巴氏杆菌康复血清的反应Western blot结果显示，多杀性巴氏杆菌OmpH2能够与多杀性巴氏杆菌康复血清发生特异性反应。作为阴性对照的红斑丹毒丝菌SpaA泳道未见符合预期大小（60 kDa）的条带，作为阳性对照的巴氏杆菌GAPDH（41 kDa）泳道和OmpH2（43 kDa）泳道均存在一条符合预期大小的条带（图2B）。

2.4 rOmpH2与Fn和Plg的结合活性针对Fn和Plg结合作用检测的Far Western blot结果显示，rOmpH2泳道上均存在一条约43 kDa的条带，与rOmpH2大小一致，未孵育Fn或Plg的对照NC膜上未见符合预期大小的条带（图3），即rOmpH2具有结合Fn和Plg的能力。

2.5 rOmpH2多克隆抗体的Fn和Plg结合抑制作用ELISA结果显示，rOmpH2 IgG孵育处理后，多杀性巴氏杆菌对于Fn和Plg的结合能力显著下降。经过rOmpH2 IgG孵育后多杀性巴氏杆菌对Fn和Plg的结合能力均显著下降，分别下降了30%、20%左右（图4）。

图1 OmpH1和OmpH2一级结构的比较Fig.1 Comparison of primary structure of OmpH1 and OmpH2

图2 重组rOmpH2蛋白的表达及与康复血清的反应Fig.2 Recombinant expression of rOmpH2 and its reactivity with recover serum

3 讨论

孔蛋白OmpH是多杀性巴氏杆菌的一种主要的外膜蛋白，具有2个拷贝的基因[10]。已有研究发现OmpH1在巴氏杆菌致病机制中发挥黏附作用[12-13]。尽管OmpH2与OmpH1的氨基酸序列存在一定差异，但是它们之间存在高度相似的局部区域，因而OmpH2可能也具有类似的功能，因此我们对OmpH2的黏附作用开展了研究。

病原菌免疫原性较好的分子也常常在其致病过程中发挥作用[24-25]。本研究首先表达了多杀性巴氏杆菌的rOmpH2蛋白，并对其致病机理展开了初步研究。Western blot表明，rOmpH2与多杀性巴氏杆菌高免血清存在明显的反应。这一结果与另一个团队的检测结果一致[14]，表明OmpH2可能在多杀性巴氏杆菌感染与免疫反应中发挥重要作用。

Fn是细胞外基质的重要组成成分。很多病原菌通过结合该分子实现对宿主细胞的黏附进而发挥致病作用[26]。结合Fn同样也是多杀性巴氏杆菌黏附宿主细胞的重要途径[27]。但是Fn增强多杀性巴氏杆菌黏附的分子机制还不完全清楚。Plg是动物体内重要的黏附分子，有多个可以与其他分子发生结合的结构域。很多病原菌通过结合Plg增强对宿主细胞的黏附作用[25,28]。本实验室前期报道了多杀性巴氏杆菌能够利用Plg[29]。本研究发现rOmpH2能够结合Fn和Plg，而且rOmpH2多克隆抗体能够显著抑制多杀性巴氏杆菌对Fn和Plg的结合。因此，OmpH2还可能在多杀性巴氏杆菌结合细胞外基质成分Fn和宿主Plg过程中发挥作用，进而促进多杀性巴氏杆菌对宿主细胞的黏附作用。

图3 Far Western blot检测rOmpH2对宿主Fn和Plg分子的结合作用Fig. 3 Detection of binding activity of rOmpH2 to host Fn and Plg via Far Western blot

图4 OmpH2多克隆抗体对多杀性巴氏杆菌黏附宿主Fn和Plg的抑制作用Fig. 4 Inhibition activity of OmpH2 polyclonal antibodies to binding activity of P. multocida to host Fn and Plg