王 晔，赵其平，朱顺海，董 辉，姜连连，薛 璞，舒凡帆，黄 兵，韩红玉

（1.中国农业科学院上海兽医研究所 农业农村部动物寄生虫学重点实验室，上海 200241；2.华南农业大学兽医学院，广州 510642）

鸡球虫病是由顶复门艾美耳属（Eimeria spp.）的艾美耳球虫寄生于鸡肠道引起的一种原虫病。鸡感染球虫后会引起食欲下降、营养吸收障碍、饲料转化率下降、增重降低，甚至死亡，给养禽业造成了很大的经济损失[1]。目前鸡球虫病的防治手段主要以药物预防为主，随着球虫耐药性的不断增加和人们对食品安全问题的日益关注，迫切需要一种更安全有效的防治球虫病的方法。基因工程疫苗是未来防治鸡球虫病的趋势，也是近些年来研究的热点，而能否筛选出具有免疫保护性的抗原是构建基因工程疫苗的关键。

顶复门原虫的顶膜抗原1（apical membrane antigen 1，AMA1）是微线体分泌的一种保守蛋白，可与虫体的棒状体颈部蛋白一起形成运动环结构（moving junction，MJ），在虫体入侵宿主细胞过程中起着关键作用。据文献报道，AMA1还参与了虫体顶体再定位（apical reorientation）[2]、虫体的粘附（intimate attachment）[3]、棒状体蛋白的分泌[4]，以及为虫体在细胞内的复制提供启动信号[5]。已有研究证实免疫恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）重组AMA1蛋白后的小鼠和猴可产生保护性免疫反应[6]。近年来也确认AMA1在其他顶复门原虫如巴贝斯虫（Babesia）、弓形虫（Toxoplasma）和新孢子虫（Neospora）中是具有免疫保护作用的蛋白[7-9]。在艾美耳球虫中，Jiang等[10]首次报道了柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenell）AMA1（EtAMA1）基因，并在体外用多克隆抗体抑制EtAMA1蛋白后观察到子孢子的细胞入侵率下降了70%，表明EtAMA1对球虫入侵宿主细胞起重要的作用。利用重组EtAMA1蛋白免疫鸡对同源虫株攻击能产生保护性免疫反应，如Li等[11]用表达AMA1抗原的重组卡介苗BCG/pMV261-AMA1和BCG/pMV361-AMA1经三种途径免疫鸡，同源株攻虫后经皮下和滴鼻途径免疫的重组卡介苗组显示了较好的免疫保护效果，在增重和卵囊减少率方面与未免疫攻虫组差异显著。Li等[12]用可表达EtAMA1蛋白的乳酸乳球菌经口服免疫雏鸡，然后进行同源攻虫的免疫保护实验，结果显示具有一定的免疫保护作用。而且最近的研究显示在柔嫩艾美耳球虫虫体上引入了巨型艾美耳球虫的AMA1基因，将其作为活载体疫苗免疫雏鸡，在巨型艾美耳球虫攻虫后，可产生与单独使用AMA1基因DNA疫苗或重组蛋白疫苗相当的保护力，这不仅证实了AMA1抗原作为疫苗的潜力，也为今后研制针对艾美耳球虫属多种球虫具有交叉保护力的多价疫苗提供了可能[13]。

鸡IFN-γ是一种具有抗病毒、抗寄生虫和抗细菌等广泛生物学活性的细胞因子，可作为免疫佐剂与疫苗联合使用，提高机体自身的免疫应答能力和疫苗的免疫保护作用，而且球虫疫苗研究中也证实IFN-γ对疫苗具有明显的免疫协同作用，能增强球虫疫苗的免疫保护效力[14-16]。本研究将柔嫩艾美耳球虫 AMA1 基因和鸡 IFN-γ基因分别插入pCAGGS载体的两个多克隆位点，构建了两种真核表达载体pCAGGS-EtAMA1和pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ，以检测其对柔嫩艾美耳球虫人工感染的免疫保护效果。

1 材料与方法

1.1 材料柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA、兔源性抗rEtAMA1多克隆抗体，由本课题组制备保存。真核表达载体pCAGGS和真核细胞293T，由本所禽病研究室李泽君老师馈赠。E. coli TOP10、DL2000（DNA Marker）购自天根生化科技（北京）有限公司。DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。rTaq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和NheⅠ，购自大连宝生物工程有限公司。pGEM-T Easy载体，购自Promega公司。Lipofectamine 2000，购自Invitrogen公司。胎牛血清、DMEM、Opti-MEM，购自Gibco公司。Western及IP细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司。红色荧光标记山羊抗兔二抗购自Jackson Immuno Research公司。近红外荧光羊抗兔IgG购自LI-COR公司。

1.2 实验动物及所用虫株实验鸡舍冲洗干净后，用开水烫洗和甲醛熏蒸消毒，通风排出残留气味。饲养鸡只的笼子在80℃下烘烤至少30 min，然后搬至鸡舍。所用实验动物三黄鸡来自上海奉贤某种鸡场。动物实验经过中国农业科学院上海兽医研究所实验动物伦理委员会批准。所用球虫株为中国农业科学院上海兽医研究所动物原虫病研究团队保存的柔嫩艾美耳球虫纯种虫株，编号为CAAS 21111601。实验前经2周龄无球虫雏鸡繁殖后备用。

1.3 EtAMA1基因的克隆以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板，根据实验室利用RACE扩增获得的含一个完整开放阅读框（open reading frame，ORF）的全长EtAMA1基因序列设计引物[10]，扩增该基因含完整ORF的序列，长度为1439 bp。引物由上海桑尼生物技术有限公司合成，其中上游引物序列：5'-GCGAATTCATGCAGCCGCCCTAT-3'，下游引物序列：5'- GCCTCGAGGCTGGTGTTGTTG TT-3'。上游引物引入EcoRⅠ酶切位点，下游引物引入XhoⅠ酶切位点。PCR反应总体积20 μL，其中模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，rTaq DNA聚合酶1 μL，dNTPs 2 μL，10×PCR Buffer 2 μL，灭菌水补至20 μL。反应条件：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，50℃退火40 s，72℃延伸90 s，30个循环；最后72℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶回收目的片段。将纯化的目的片段经连接酶与pGEM-T Easy载体连接，连接产物转化至E.coli TOP10感受态细胞中，培养过夜后挑取白色单菌落培养，PCR鉴定后提取质粒，进行双酶切鉴定并测序。

1.4 pCAGGS-EtAMA1真核重组表达质粒构建利用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分别对鉴定正确的重组质粒pGEM-T Easy-EtAMA1和pCAGGS载体进行双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收纯化试剂盒分别回收目的片段，16℃连接过夜后转入E.coli TOP10感受态细胞中，涂板培养过夜，挑取单菌落于4 mL LB培养基中培养12 h后，进行PCR鉴定，对鉴定为阳性的菌液提取质粒进行双酶切鉴定，将酶切和PCR鉴定后的正确重组质粒命名为pCAGGS-EtAMA1。

1.5 鸡IFN-γ基因的克隆以本研究室之前保存的鸡脾脏cDNA为模板，PCR扩增IFN-γ基因。IFN-γ上游引物：5'- GTGCTAGCATGACTT GCCAGACTTAC- 3'（NheⅠ），IFN-γ下游引物：5'-GTGCTAGCATTAGCAATTGCATCTCCT-3'（NheⅠ），上、下游引物均包含NheⅠ酶切位点。引物PCR扩增片段大小为496 bp，包含完整的鸡IFN-γ基因开放阅读框。回收PCR产物，并将目的片段连接到pGEM-T Easy载体上，转化到大肠杆菌Top10感受态细胞中，提取质粒后用NheⅠ内切酶进行酶切鉴定。鉴定为阳性的菌株命名为pGEM-T Easy-IFN-γ并送至上海桑尼公司测序。

1.6 pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ真核重组表达质粒构建将pGEM-T Easy-IFN-γ质粒和鉴定为阳性的pCAGGS-EtAMA1重组质粒分别用NheⅠ进行酶切，胶回收IFN-γ基因片段和pCAGGS-EtAMA1，然后16℃水浴中连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌Top10 感受态细胞中，PCR鉴定为阳性后，对插入的IFN-γ基因进行测序。将鉴定正确的IFN-γ基因正向插入的重组质粒命名为pCAGGSEtAMA1-IFN-γ。

1.7 293T细胞的复苏培养用含5%胎牛血清的DMEM培养293T 细胞。转染前，收集293T细胞进行细胞计数，以每孔5×105个细胞铺被6孔板2块，37℃、5%CO2培养过夜，按照LipofectamineTM2000脂质体转染操作步骤，分别将pCAGGS空载体和重组质粒pCAGGS-EtAMA1转染293T细胞，置于37℃。5%CO2培养4 h，更换含有2%胎牛血清的opti-MEM培养基。培养48 h后，取其中一块6孔板进行间接免疫荧光，收集另一块6孔板的293T细胞用于Western blot检测。

1.8 间接免疫荧光（indirect fluorescent assay，IFA）鉴定pCAGGS-EtAMA1的表达情况在培养48 h后，取转染后的293T细胞，用2%多聚甲醛1 mL固定15 min，PBST洗涤3遍。加入1% Triton X-100 1 mL，室温下作用15 min，用PBST洗3次。加入2%BSA/PBS 2 mL，4℃封闭过夜，PBST洗涤3遍。加入兔源性抗rEtAMA1蛋白的多克隆抗体，37℃作用1 h，PBST洗涤3次。加入1∶500稀释的红色荧光标记的山羊抗兔二抗，37℃作用1 h，再用PBST洗涤6次。加入PBST 1 mL，荧光显微镜（Nikon 80i）下观察，并拍照保存。

1.9 Western blot鉴定pCAGGS-EtAMA1的表达情况收集1.7中培养48 h的293T细胞，加入细胞裂解液100 μL，4℃、12 000×g离心3 min，取上清进行SDS-PAGE电泳。半干法电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜，PBS洗涤3次。加入1∶100稀释的兔抗rEtAMA1蛋白多抗血清，37℃孵育2 h，PBS洗膜3次。加入1∶10 000稀释的近红外荧光羊抗兔IgG，37℃孵育2 h，PBST洗膜1次，PBS洗膜3次。用Odyssey双色红外激光成像系统进行拍照。

1.10 动物分组及免疫1日龄肉鸡饲养于洁净已消毒的实验动物房，在7日龄时进行称重，挑选90～106 g的肉鸡随机分组，然后进行适当调整，使各组平均初重基本相同。80只鸡分为5组，每组16只。第1组为pCAGGS-EtAMA1免疫组，第2组为pCAGGSEtAMA1-IFN-γ免疫组，第3组为pCAGGS空载体免疫组，第4组为未免疫未攻虫组，第5组为未免疫攻虫组。分组后每只鸡都贴好脚标，以免混淆，每6 d更换脚标1次。1～3组分别于7日龄、14日龄在腿部肌肉注射100 μg/只重组质粒，两次注射位点一致。注射重组质粒前，先在每只鸡腿部注射0.2 mL高渗蔗糖溶液并按摩，15～20 min后，在相同部位注射重组质粒。未免疫未攻虫组和未免疫攻虫组注射100 μL PBS溶液。21日龄时除未免疫未攻虫组外，其余各组每只鸡均经口感染1×104个新鲜柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊。

1.11 免疫保护评价指标免疫保护效果通过平均增重、盲肠病变记分和卵囊减少率进行评价。本次实验共称重4次。即在一免时、一免后第7 d、二免后第7 d、攻虫后第8 d进行称重。统计各组每个时期的平均增重，平均增重1（g/羽）=攻虫当天平均重量-初始分组平均重量；平均增重2（g/羽）=试验结束后平均重量-攻虫当天平均重量；相对增重率=实验组平均增重2/未免疫未攻虫组平均增重。盲肠病变记分参照文献[17]的方法进行。从攻虫后第5 d到攻虫后第8 d这段时间每天收集各组的粪便，多点采集粪样，混匀后，采用麦克马斯特法进行卵囊计数。卵囊减少率（%）=［（未免疫攻虫组卵囊数-免疫组卵囊数）/未免疫攻虫组卵囊数］×100%。平均增重和盲肠病变记结果分运用SPSS软件进行统计学分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA analysis）中的Duncan's multiple range test进行多组样本间差异显著性分析，P＜0.05为差异显著，具有统计学意义。

2 结果

2.1 EtAMA1基因的克隆以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板， PCR扩增出一条大约1439 bp的目的条带；将其与pGEM-T Easy载体连接，转化E. coli TOP10感受态细胞后，菌液经PCR鉴定出现与预期大小一致的片段（图1A）；质粒经双酶切鉴定，可见2条带，其大小也与预期目的条带一致（图1B）；测序结果表明与原序列一致。以上结果表明成功克隆了EtAMA1基因。

2.2 真核重组表达质粒pCAGGS-EtAMA1的构建和鉴定分别用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对鉴定正确的重组克隆质粒pGEM-T Easy-EtAMA1和空载体pCAGGS进行双酶切，纯化后进行连接，构建了真核重组表达质粒pCAGGS-EtAMA1。对该重组质粒的PCR（图2A）及双酶切（图2B）产物进行电泳，所获条带大小与预期一致。

图1 pGEM-T Easy-EtAMA1的PCR及双酶切鉴定结果Fig.1 Results of PCR detection and restriction enzyme analysis of pGEM-T Easy-EtAMA1

图2 阳性重组质粒pCAGGS-EtAMA1的PCR及双酶切鉴定Fig.2 Results of PCR detection and restriction analysis of recombinant plasmid pCAGGS-EtAMA1

2.3 鸡IFN-γ基因PCR扩增结果及序列分析PCR产物电泳结果显示，有一条大小约为500 bp的条带，与鸡IFN-γ基因（496 bp）大小预期一致（图3）。将PCR产物纯化回收后与pGEM-T Easy载体连接，构建重组质粒pGEM-T Easy- IFN-γ，经内切酶NheⅠ酶切，出现大小约为500 bp的目的条带（图4）。阳性重组质粒测序结果显示，IFN-γ与GenBank所发表序列有一个碱基发生突变，碱基相似性为99%，氨基酸序列中第125位氨基酸由M变为K，无移码突变，不影响该蛋白功能，氨基酸同源性为99%。

图3 鸡IFN-γ基因 PCR扩增结果Fig. 3 Results of PCR amplification of chicken IFN-γ gene

2.4 重组质粒pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ的构建及鉴定将构建的重组质粒pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ用PCR方法扩增，结果在大小约为500 bp处有一条目的条带（图5），并送至上海桑尼公司测序，测序结果显示IFN-γ基因正向插入pCAGGS载体，表明pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ构建成功。

2.5 间接免疫荧光（IFA）检测pCAGGS-EtAMA1在293T细胞中的表达利用兔抗rEtAMA1蛋白多克隆抗体，对重组质粒pCAGGS-EtAMA1转染48 h后的293T细胞进行免疫荧光检测。结果显示，在转染pCAGGS-EtAMA1重组质粒的293T细胞中，可以看到特异的红色荧光（图6A）；而在转染pCAGGS空载体的293T细胞中，则无红色荧光（图6B）。

2.6 Western blot分析pCAGGS-EtAMA1在293T细胞中的表达Western blot分析结果显示，在转染重组质粒pCAGGS-EtAMA1的293T细胞中，可以检测到大小约为58 kDa的蛋白质条带；而在转染空载体质粒的293T细胞中，未检测到相应的目的条带（图7）。

图4 pGEM-T Easy-IFN-γ双酶切鉴定结果Fig. 4 Results of restriction analysis of pGEM-T Easy-IFN-γ plasmid

图5 重组质粒pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ的PCR鉴定Fig. 5 Results of PCR detection of recombinant plasmid pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ

图6 转染重组质粒pCAGGS-EtAMA1的293T细胞的间接免疫荧光检测Fig. 6 IFA analysis of the 293 T cell transinfected with pCAGGS-EtAMA1

图7 EtAMA1重组蛋白Western blot分析结果Fig. 7 Western blot analysis of recombinant proteinEtAMA1

2.7 免疫保护效果每组鸡在柔嫩艾美耳球虫攻虫后均未出现死亡。平均增重1、平均增重2、病变记分和卵囊减少率结果见表1。未免疫攻虫组相较未免疫未攻虫组表现出严重的盲肠病变，平均增重显著下降（P＜0.05）。pCAGGS-AMA1和pCAGGSAMA1-IFN-γ组相比未免疫攻虫组平均增重2较大，但是差异不显著（P＞0.05）。这两组在盲肠病变记分方面相比未免疫攻虫组则有显著的减轻（P＜0.05）。pCAGGS-AMA1-IFN-γ组的卵囊减少率高于其他4组，达到72.89%。

表1 2种重组质粒对雏鸡E. tenella人工感染的免疫保护效果Table 1 Protection effects of the 2 recombinant plasmids against chicken E. tenella challenge

3 讨论

由于球虫耐药株的出现、传统活疫苗存在毒力返强以及制备成本较高等原因，越来越多的研究将重组疫苗作为控制球虫病的替代方法[18]。DNA疫苗是一种很好的可替代传统治疗的手段，其注射进动物体内后可表达产生质粒DNA所编码的抗原，激发体液免疫和细胞免疫反应[19]。DNA疫苗能够大量制备、无感染风险、成本低且能稳定储存数月。

顶复门寄生虫微线体蛋白中的顶膜抗原（AMA1）近年来成为研究热点，该蛋白在疟原虫中被首次发现。AMA1为Ⅰ型跨膜蛋白，在顶复门寄生虫（如疟原虫、弓形虫、巴贝斯虫、犬新孢子虫）中保守。近几年多种与艾美耳球虫AMA1基因相关的疫苗相继被研究报道。本实验初步研究了所构建的真核表达质粒pCAGGS-EtAMA1和pCAGGSEtAMA1-IFN-γ的免疫保护效果，以观察EtAMA1的抗球虫效果。实验结果表明，两种真核表达质粒对鸡柔嫩艾美耳球虫感染均具有一定的免疫保护力。免疫保护实验的结果与免疫剂量、免疫途径、免疫次数及间隔时间等因素有关，本实验参考Song等[20]筛选优化的免疫程序，采用100μg的剂量经肌肉注射免疫，7日龄时初次免疫，14日龄加强免疫。考虑到本次实验是对该抗原的重组基因疫苗保护力的初步探讨，攻虫剂量为1万个/羽，所用卵囊为新鲜柔嫩艾美耳球虫卵囊。两次免疫后攻虫，免疫组均可明显减少卵囊产量，其中pCAGGS-EtAMA1重组质粒组卵囊减少率为67.43%，pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ重组质粒组卵囊减少率为72.89%；两免疫组较未免疫攻虫组在盲肠病变计分方面下降很多，差异较显著；在相对增重方面，pCAGGS-EtAMA1重组质粒组相对增重率为93.95%，pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ重组质粒组相对增重率为97.27%，相对增重率较高，可能与攻虫剂量较小、饲养环境较好有一定关系，因为感染非免疫组的相对增重也达到了85.69%。Hoan等[21]用布氏艾美耳球虫（E. brunetti）AMA1（EbAMA1）基因DNA疫苗pVAX1-EbAMA1和AMA1重组蛋白疫苗进行的同源攻虫免疫保护实验显示，pVAX1-EbAMA1组的卵囊减少率为74.55%，AMA1重组蛋白组的卵囊减少率为47.74%，与本实验结果基本一致。

真核表达载体pCAGGS含有鸡的β-actin启动子和CMV增强子，被广泛应用于DNA疫苗的研制，已有研究[22-23]证明其有很高的表达效率。本研究采用的真核表达载体是张树梅等[24]在pCAGGS载体的基础上改造的载体，增加了SV40启动子和单疱疹病毒（HSV）TK基因的polyA序列，还有内部核糖体进入位点序列（IRES），增加了两个克隆位点。其中一个克隆位点位于SV40强启动子和HSV-TK-polyA终止序列之间，本研究在这个克隆位点插入鸡细胞因子IFN-γ基因。AMA1基因则插入到原有的多克隆位点，在CMV增强子和鸡β-actin启动子的调控下进行高效表达。本研究中pCAGGS-EtAMA1-IFN-γ重组质粒组的免疫效果，无论从卵囊减少率、盲肠病变记分还是相对增重率上，都要优于pCAGGS-EtAMA1重组质粒组，只是在相对增重率上两者差异不显著。这进一步说明鸡IFN-γ与疫苗连用可提高宿主自身的免疫应答能力和疫苗的免疫保护效果。

综上所述，本研究评价了用EtAMA1基因的两种真核表达质粒免疫鸡群后，对鸡柔嫩艾美耳球虫感染的保护效果，为深入研究EtAMA1基因的功能和开发球虫 DNA疫苗奠定了基础。