庄子萌， 蒋叶香， 阿迪拉·阿里木， 张珺媛， 蒋沐岐， 宋 耿， 梁华敏， 王 维， 朱敏洁

华中科技大学同济医学院基础医学院生理学系，武汉 430030

近年来空气质量问题备受关注，“雾霾”的重要组成成分细颗粒物(fine particulate matter，PM2.5)更是近年来环境卫生研究的热点。空气中的颗粒物进入气道后的位置与其直径大小有关，直径小于2.5 μm的细颗粒物可以进入肺泡，引起全身毒性[1]。根据流行病学调查，妊娠期暴露于PM2.5与多种先天性心脏畸形(congenital heart defects，CHDs)有关[2-5]。CHDs是心脏结构的先天发育畸形，发病率高且治疗费用昂贵，平均每300名新生儿中就有1例CHDs发生，在发达国家CHDs造成的新生儿死亡人数占总新生儿死亡人数的1/3[6]，研究CHDs的危险因素对减轻医疗卫生负担和提高民众健康水平有着重要意义。然而PM2.5引起CHDs的机制仍不明确，目前对机制的研究主要集中于氧化应激与炎症反应[7]、甲基化水平改变和线粒体功能障碍[6]等方面，这些生物学效应与PM2.5组分和各组分的协同作用有关。从交通尾气中提取的PM2.5可以分为水溶性成分、有机成分、碳芯成分，单独作用时，有机成分的生物学效应最明显，碳芯成分的生物学效应最弱，而水溶性成分和有机成分的联合作用与PM2.5整体作用时产生的生物学效应相似，且这种联合作用强于任一组分的单独作用[8]。DNA甲基化是一种共价修饰，主要指胞嘧啶的第5号碳原子在DNA甲基转移酶的作用下被甲基化修饰为5-甲基胞嘧啶，属于表观遗传学的范畴，是真核生物在染色质水平控制基因转录的重要机制。虽然目前的研究尝试通过甲基化水平改变将PM2.5暴露与CHDs联系起来，但是甲基化水平改变与CHDs直接关联的机制仍未确定，本文将从甲基化水平改变这一可能机制对PM2.5暴露与CHDs的关系进行综述。

1 PM2.5影响DNA甲基化的机制

PM2.5可通过影响甲基供体水平和DNA甲基转移酶活性对DNA甲基化产生作用。PM2.5会干扰甲基供体S-S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)的合成，降低SAM水平，使SAM与S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosyl homocysteine，SAH)比值下降，从而导致DNA总体低甲基化[8]。DNA甲基转移酶将甲基供体SAM转移到DNA上的组蛋白[9]，体外实验发现PM2.5反复暴露后DNA甲基转移酶活性降低，且降低的水平与浓度有关[10]，DNA甲基转移酶活性的降低也会引起甲基化水平降低，从而使PM2.5影响DNA甲基化水平。

PM2.5暴露会导致总体甲基化水平降低[11-12]，并改变个别基因通路甲基化水平[13-15]，但后者研究较少。PM2.5暴露会引起心脏和肺的甲基化水平下降[10，16]，动物实验发现妊娠期暴露于柴油废气(DE)组成的PM2.5会降低富含CpG的区域中DNA的甲基化水平[11]。

2 CHDs发生中的甲基化水平改变

甲基化水平改变是解释CHDs发生的可能机制之一，甲基化水平改变的位点和变化方向影响基因的转录，从而增加CHDs发病风险。基因内部位点的高甲基化与基因表达升高有关，而启动子区域高甲基化则会抑制下游基因的表达[17]；总体甲基化水平降低与染色体稳定性降低和基因组功能改变有关[18]。胎盘或胎儿某些基因甲基化的改变可增加CHDs发病风险，有研究认为胎盘DNA胞嘧啶核苷酸甲基化水平可以预测法洛四联征的发生[19]。目前关于CHDs发生与甲基化水平的研究主要有两类，一类以唐氏综合征(Down syndrome)患儿为对象，唐氏综合征患儿中有40%～60%伴发CHDs，是目前研究甲基化水平CHDs的良好模型；另一类研究以发生与未发生CHDs的胎儿为对象。这两类研究均有对于甲基化水平改变的报道。

针对CHDs患儿的研究已发现许多与心脏形态或心血管疾病有关的基因甲基化发生了有意义的改变，例如MSX1基因[17]、GATA4基因[17]、PRDM16基因[20]、APOA5基因[21]、Wnt/β-catenin信号传导通路[22]。MSX1是编码肌节同源盒基因家族的一个成员[17]，已在动物实验中证实其可以抑制动脉圆锥处细胞过度增殖，参与流出道形态的形成[23]。在发生CHDs的心脏中检测到MSX1基因内部甲基化水平升高[17]。在室间隔缺损病例中发现PRDM16基因一个位点甲基化水平明显升高，该基因表达抑制TGF-β信号传导的蛋白PRDM16，而TGF-β信号传导控制组织形态学发生，对室间隔形成起重要作用，敲除TGF-β2基因会引起包括室间隔缺损在内的严重的心脏畸形[20]。APOA5基因与血浆三酰甘油水平相关，该基因的2种亚型可作为高脂蛋白血症的生物标志物，有研究发现在主动脉瓣狭窄者APOA5基因甲基化发生有意义变化，但对这种改变是否会增加主动脉瓣狭窄风险仍存分歧[20-27]。GATA4基因在心脏发育中起作用，GATA4基因的变异与包括法洛四联征、主动脉瓣缺损、室间隔缺损等在内的许多种CHDs有关，该基因转录很大程度上受其翻译产物的调节，GATA4第300号赖氨酸的甲基化会降低GATA4基因的转录[24]。在CHDs患儿中检测到GATA4基因甲基化水平升高，但这种变化在不伴发CHDs的唐氏综合征病例中也可检测到[17]，故两者关系仍待探讨。以上针对单个已知作用的基因甲基化水平改变的研究提示甲基化在CHDs发生中的确发挥一定作用。甲基化水平变化可以反映基因表达水平的改变，同时甲基化作为表观遗传学的理论之一，可将环境因素与CHDs发生相关联以解释环境因素作用机制。

3 PM2.5引起CHDs的机制

PM2.5对总体和局部基因甲基化水平的影响是解释其诱导CHDs发生的机制之一。PM2.5暴露导致的总体甲基化水平降低[11-12]可能会降低染色体稳定性，导致基因组功能改变[18]，影响发育。尽管现有研究可以证明PM2.5暴露会引起存在基因特异性的甲基化水平变化，并可寻找到变化位点[8，10]，但直接将PM2.5暴露、甲基化水平改变、CHDs联系起来解释PM2.5生物学机制的研究仍较少。PM2.5暴露会影响Wnt/β-catenin信号传导通路。Wnt/β-catenin信号传导是胚胎发育中一个重要的通路，涉及包括心肌细胞在内的许多细胞的分化过程，此通路的异常调节会引起包括CHDs在内的多种先天畸形，而组蛋白H3K4甲基化在Wnt应答基因中发挥核心作用，Wnt信号传导可以稳定β-catenin[22]。PM2.5中的可萃取有机成分可作为AhR的激动剂，AhR的激动可对抗Wnt/β-catenin信号传导，从而增加子代CHDs患病率[13]，叶酸对此有保护作用[28]，叶酸参与一碳单位代谢产生甲基供体SAM可能是叶酸在此过程中具有保护作用的原因[22]。补充叶酸可以抵消PM2.5降低SAM/SAH比值的作用，减弱PM2.5对控制DNA甲基化基因的表达影响，这些基因包括dnmt1、dnmt4、uhrf1、tet2、gch1、qdprb等[15]。

尽管有以上研究认为甲基化水平改变可能是PM2.5引起CHDs的机制之一，但仍有研究发现三者的联系存疑。PM2.5作用后针对胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)位点的检测发现，并不是所有的位点都会发生甲基化改变，发生改变的位点也并不是同一时间出现的[29]。CHDs患儿甲基化水平的研究在甲基化改变方向上目前也有争议，有研究发现CHDs患儿全基因组甲基化水平是降低的，但其中甲基化水平变化有意义的位点甲基化水平往往是升高的，而且这些位点大多位于控制转录的区域[17]，局部甲基化升高与目前认为PM2.5降低甲基化水平的作用相悖[8-10]。同时甲基化改变对转录水平的影响程度也有待探讨，动物实验发现妊娠期暴露于柴油废气中的PM2.5后，只有小部分区域附近的转录水平有明显改变，虽然相关基因涉及细胞代谢、信号转导等重要生命活动，但是有改变的基因数仍然比预期要少。柴油废气暴露的子代成年后心肌肥大和心力衰竭患病率仍然增加，提示甲基化水平改变的影响可能需要在环境压力的作用下才能体现[11]。

甲基化水平改变也可能是机体保护机制的反映，这使PM2.5作用机制更加复杂，也表明甲基化水平变化是否为PM2.5对子代心血管系统产生影响的机制之一仍待确认。瘦素(leptin，LEP)是胎儿生长发育中的一个能量调节激素，在胚胎植入、子宫内生长和胎儿发育中均发挥作用，LEP与其受体结合会刺激血管内皮生长因子等血管生成因子产生，激活p38、MAPK和Akt通路，从而诱导细胞增殖、迁移和血管生成[14]。有研究发现左心发育不全综合征患儿胎盘LEP水平增加，并猜测LEP表达增加是对血管异常的代偿[30]。妊娠中期暴露于PM2.5会使LEP启动子甲基化水平下降，从而提高LEP水平，胎盘LEP启动子水平又与一种氧化应激和硝化应激标志物胎盘3-NTp的水平呈负相关[14]，而氧化应激和硝化应激是目前对PM2.5损伤作用的主流解释[1]，故猜测PM2.5暴露后LEP水平升高可能是机体的保护性反应。

4 甲基化水平改变在PM2.5作用机制研究中的应用展望

甲基化水平改变作为PM2.5暴露引起CHDs的可能机制之一，还可作为PM2.5产生生物学作用的标志，检测PM2.5发生作用的时间窗口，验证环境因素的作用是否存在，从而引导进一步的研究。

有研究发现某些污染物对先天缺陷发病增加的影响存在不同的时间窗口[31-32]，PM2.5暴露也可能存在时间窗口，且这个时间窗口可能早于胚胎心脏发育时间[31]，针对时间窗口的研究对孕期保健有指导作用；甲基化水平改变可早于形态学变化，以甲基化水平改变为研究指标可缩小PM2.5暴露时间窗口的宽度。以往的研究多局限于追溯新生儿CHDs发生与孕期暴露浓度，只能将时间范围局限在妊娠中的若干周，研究的时间段较为宽泛，如研究发现室间隔缺损与妊娠第7～10周的PM2.5暴露显著相关[33]，房间隔缺损、心内膜垫缺损和肺动脉瓣狭窄与妊娠第3～8周的PM2.5暴露显著相关[34]，有的研究甚至不关注时间窗口[35]。通过测定甲基化，可以缩小PM2.5暴露时间窗口的宽度。研究发现PM2.5浓度增加与12个位点的CpG变化有关，且随着暴露时间增长，相关的甲基化变化位点越多，其中2个位点在妊娠后第2、7、28天的甲基化水平存在显著性差异[29]；但该研究时间段划分粗略，并不能确定最明确的时间窗口。其他研究缩小了时间窗口，发现妊娠后第53天PM2.5暴露与肺动脉瓣狭窄的发生有关，妊娠第50天和第51天的PM2.5暴露与法洛四联征发生有关，该结果符合胎儿心血管系统发育的时期。但PM2.5暴露作用可能并不只发生在某段时间中，体外研究显示反复低水平PM2.5暴露会引起表观遗传学改变[36]，这说明最显著时间点存在有可能是长时间暴露后效应积累产生质变。

甲基化改变不仅可以用于解释PM2.5作用机制，也可以作为其他研究的辅助工具。目前对妊娠前母亲的PM2.5暴露是否与子代CHDs发病率升高有关还存在争议。有人认为PM2.5暴露对后代心血管系统的影响可能不仅限于妊娠期通过胎盘影响胚胎发育，亲代的接触同样会引起子代心脏发育异常，并认为其机制与PM2.5对成人心血管系统影响机制可能有相同之处，如引发氧化应激和炎症反应，但针对PM10在妊娠期暴露的研究并未发现其与CHDs存在联系[33]。妊娠前后PM2.5暴露的动物实验研究发现，细颗粒物会引起基因表达改变，妊娠前接触可能通过表观遗传影响子代心脏发育。PM2.5可引起人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)细胞内微核产生率增加，诱发细胞染色体损伤[37]，故也可能引起生殖细胞染色体损伤，产生遗传毒性。为明确妊娠前PM2.5暴露的影响，未来的妊娠前暴露研究可尝试应用甲基化水平的测定来验证影响的存在。