霍宇航，李檐堂，刘丽丽，张云云，鲁周民*

（莫北农林科技大学林学院，陕莫 杨凌 712100）

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）为蔷薇科枇杷属常绿果树，果实酸甜可口，深受人们喜爱，枇杷叶药食兼用不仅是枇杷膏、利肺片[1]等药品的原料，还被加工成枇杷叶茶、枇杷叶糖、枇杷叶饮料[2]等功能食品。枇杷叶毒性低[3]，具有抑咳[4]、降血糖、抗抑郁和抗肿瘤等药理活性[5]，并对骨质疏松[6]和慢性支气管炎[7-8]等多种慢性病有防治功能。同时枇杷叶还具有美容和瘦身等功效[9-10]。多种药理活性和其低毒的特性使枇杷叶茶[5]、枇杷叶和绿茶的混合茶[11]等枇杷叶产品成为非常有潜力的保健食品。有研究表明枇杷叶中富含的多酚类、黄酮类和三萜酸类是构成枇杷叶保健作用、影响其本身及加工制品品质的重要因素[12-13]。

枇杷叶作为原材料是影响其制品质量的关键因素[14]，枇杷叶全年均可采回[15]，有研究表明新叶、成熟叶、老叶3 个成熟度的枇杷叶片黄酮、总三萜酸、总糖含量依次递增[16-17]，不同品种枇杷叶中的总酚、黄酮、熊果酸、齐墩果酸含量存在差异[18-19]，不同采摘月份枇杷叶三萜酸类含量也存在差异[20]。对石榴叶在不同季节功能成分的研究表明，多酚类、黄酮类、生物碱类成分含量随生长时间有一定变化趋势[21]，对同一采回时期不同采集位点烟叶的研究也显示存在代谢物的差异[22]。而关于不同品种和同一品种枝条上不同叶位枇杷叶的功能成分含量及变化规律鲜见报道。

本研究以总酚、没食子酸、绿原酸、新绿原酸、黄酮、儿茶素、芦丁、异槲皮苷以及总三萜酸、熊果酸、齐墩果酸和科罗索酸共12 种主要功能成分为指标，对6 个品种枇杷树树冠外围当年同一时期生长的枝条上不同叶位的叶片进行分析，比较不同品种、不同叶位的枇杷叶在主要功能成分含量上的差异，并揭示枇杷叶片功能成分随叶位的变化规律，旨在为枇杷叶的相关研究和评价提供理论参考，并为枇杷叶功能成分在医疗保健和功能食品方面的应用提供一定的技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枇杷品种为生长于莫北农林科技大学发康北亚热带经济林果树试验示范站的‘长崎早生’、‘白茂木’、‘马克’、‘佳伶’、‘大五星’和‘麦后黄’。叶片样品于2017年12月18日采集后，立即运回实验室进行预处理。

没食子酸（分析纯） 天津市光复精细化工研究所；福林-酚试剂 上海荔达生物科技有限公司；芦丁（分析纯） 广东光华科技股份有限公司；色谱纯标准品熊果酸、齐墩果酸、科罗索酸、绿原酸、芦丁、新绿原酸、儿茶素、没食子酸、异槲皮苷 上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

MULTISKAN GO型全波长酶标仪 芬兰Thermo Fisher公司；1260高效液相色谱仪 美国发捷伦公司；KH-500DE型数控超声清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司；LS 220SCS型电子天平 瑞士普利赛斯公司；H1850型台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枇杷叶采集与功能成分提取

枇杷叶采回方式为每个品种选择同一年栽种的3 棵长势一致的枇杷树作为样树，在每棵树的树冠外围选择同一发芽时期生长的5 个枝条，自枝条顶端方下分别采集第1、3、5、7、9叶位的叶片，分装标记后运回实验室。

清水洗净叶片污渍，沥干水分，剔除有病虫危害的叶片，经60 ℃烘箱烘干至恒定质量，料理机粉碎，过60 目筛备用。准确称取1.000 g枇杷叶干粉并加入30 mL 50%乙醇溶液，在设定温度30 ℃、功率100 W条件下超声提取40 min，10 000×g离心10 min，取上清液，用酶标仪测定总酚、黄酮、总三萜酸含量。每个处理重复3 次。

准确称取0.200 g枇杷叶干粉加入4 mL无水乙醇，浸提24 h后，在设定温度30 ℃、功率100 W条件下超声提取40 min，12 000×g离心15 min，取上清液，用高效液相色谱仪测定单体成分含量。每个处理重复3 次。

1.3.2 功能成分的测定

总（多）酚含量测定采用福林-酚试剂比色法。参考Hong Yanping等[18]的方法，并加以改进。分别取0、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL 7 个梯度质量浓度的没食子酸标准液或适当稀释后的样品液0.2 mL，置于加入1.5 mL水的试管中，加入0.5 mL福林-酚试剂和0.8 mL 7.5% NaCO3溶液，45 ℃水浴60 min，室温静置30 min后吸取200 μL反应液于酶标板上，以50%乙醇溶液为空白，于760 nm波长处测吸光度。总酚含量以没食子酸计，单位为mg/g（以干质量计，下同）。

黄酮含量测定采用硝酸铝-亚硝酸钠显色法。参考Hong Yanping等[18]的方法，并加以改进。分别取0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL 7 个梯度质量浓度的芦丁标准液或适当稀释后的样品液0.2 mL于试管中，加入0.6 mL 5% NaNO2溶液混匀反应5 min后，再加0.6 mL 10% Al(NO3)3溶液反应6 min，最后加入1.8 mL 4% NaOH溶液，静置15 min并吸取200 μL反应液于酶标板上，以标准液或样品液自身为空白，于波长510 nm处测吸光度。黄酮含量以芦丁计，单位为mg/g。

总三萜酸含量测定采用香草醛-高氯酸显色法。参考张爽等[23]的方法，并加以改进。取50 μL的上清液或梯度量（0、100、200、300、400、500、600 μL）熊果酸标准液于试管中，90 ℃水浴挥发溶剂，60 ℃烘箱烘干试管，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液、0.6 mL高氯酸60 ℃水浴反应15 min，冷水冷却加2.2 mL冰醋酸后吸取200 μL反应液于酶标板上，以50%乙醇溶液为空白，于波长548 nm处测吸光度。总三萜酸含量以熊果酸计，单位为mg/g。

没食子酸、儿茶素、绿原酸、新绿原酸、芦丁、异槲皮苷含量测定参考张丽贤[24]、Ferreres[25]等的方法，并加以改进。高效液相色谱测定条件：ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相由去离子水（A）、甲醇（B）、乙腈（C）、5%冰乙酸溶液（D）组成，洗脱体积流量0.4 mL/min；进样量20 μL；检测波长设定：没食子酸和儿茶素在波长275 nm，绿原酸和新绿原酸在波长330 nm，芦丁和异槲皮苷在波长360 nm；柱温25 ℃。具体的流动相梯度洗脱条件见表1。

表1 高效液相色谱法的梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions for the HPLC method

熊果酸、齐墩果酸、科罗索酸含量测定参考Zheng Meiyu等[26]的方法并加以改善。高效液相色谱测定条件：ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相由0.001%冰乙酸溶液（A）和甲醇（B）组成，采用等度洗脱0～27 min，10% A，90% B；洗脱体积流量0.5 mL/min；进样量2.5 μL；检测波长210 nm；柱温30 ℃。

1.4 数据处理

采用SPSS 25.0软件，对实验数据进行回归、多因素方差分析和主成分分析，并利用Origin 9.0软件制图。

2 结果与分析

2.1 枇杷叶主要功能成分随叶位的变化

总酚含量在‘大五星’、‘马克’和‘佳伶’3 个品种枇杷叶中随叶位的增加呈快速上升趋势，而在其余3 个品种中的变化不明显（图1A）；没食子酸含量在6 个品种枇杷叶中随叶位的增加总体呈上升趋势（图1B），而新绿原酸和绿原酸含量随叶位的增加总体呈下降趋势（图1C、D）。其中，‘马克’枇杷叶总酚含量随叶位变化趋势最为明显，第9叶位叶片总酚含量（55.86 mg/g）比第1叶位叶片增加4.51 倍；‘麦后黄’枇杷叶没食子酸含量随叶位的变化趋势较为明显，第9叶位枇杷叶没食子酸（9.54 mg/100 g）含量比第1叶位增加1.47 倍；‘大五星’枇杷叶新绿原酸、绿原酸含量随叶位变化趋势较为明显，第1叶位枇杷叶新绿原酸（385.47 mg/100 g）、绿原酸（265.79 mg/100 g）含量比第9叶位分别增加7.50 倍和2.65 倍。

图1 枇杷叶酚酸类成分含量随叶位变化Fig. 1 Variations in phenolic acid contents in loquat leaves from different cultivars with leaf position

图2 枇杷叶黄酮类成分含量随叶位变化Fig. 2 Variations in fl avonoid contents in loquat leaves from different cultivars with leaf position

黄酮含量在‘大五星’、‘马克’和‘佳伶’3 个品种枇杷叶中随叶位增加呈上升趋势，而在其余3 个品种中的变化不明显（图2A）；儿茶素含量在‘马克’和‘佳伶’枇杷叶中随叶位的增加而上升（图2B）；芦丁含量在‘大五星’、‘白茂木’、‘麦后黄’和‘长崎早生’4 个品种枇杷叶中随叶位的增加总体呈下降趋势（图2C）；异槲皮苷含量在‘大五星’和‘麦后黄’枇杷叶中随叶位的增加呈下降趋势（图2D）。其中，‘马克’枇杷叶黄酮、儿茶素含量随叶位变化趋势最为明显，第9叶位叶片黄酮（151.93 mg/g）、儿茶素（117.27 mg/100 g）含量比第1叶位叶片分别增加4.90 倍和10.75 倍 ；‘大五星’枇杷叶芦丁、异槲皮苷含量随叶位变化趋势较为明显，第1叶位枇杷叶芦丁（3.68 mg/100 g）、异槲皮苷（8.08 mg/100 g）含量比第9叶位分别增加1.39 倍和1.59 倍。

图3 枇杷叶三萜酸类成分含量随叶位变化Fig. 3 Variations in triterpenoid acid contents in loquat leaves from different cultivars with leaf position

总三萜酸含量在‘大五星’、‘马克’和‘佳伶’3 个品种枇杷叶中随叶位增加呈上升趋势，而在其余3 个品种中的变化不明显（图3A）；熊果酸含量在‘马克’、‘佳伶’、‘白茂木’和‘长崎早生’4 个品种枇杷叶中随叶位的增加总体呈上升趋势（图3B）；齐墩果酸含量在‘马克’、‘佳伶’、‘白茂木’、‘麦后黄’和‘长崎早生’5 个品种枇杷叶中随叶位的增加总体呈上升趋势（图3C）；科罗索酸含量在6 个品种枇杷叶中均随叶位的增加总体呈上升趋势（图3D）。其中，‘马克’枇杷叶总三萜酸含量在叶位间差异最大，第9叶位叶片总三萜酸（53.26 mg/g）含量比第1叶位叶片增加4.54 倍；‘白茂木’枇杷叶熊果酸、齐墩果酸、科罗索酸含量随叶位变化趋势最为明显，第9叶位枇杷叶熊果酸（18.38 mg/g）、齐墩果酸（3.16 mg/g）、科罗索酸（8.54 mg/g）含量比第1叶位分别增加45.41%、48.36%和2.40 倍。

12 种功能成分在每个枇杷品种不同叶位叶片中的含量不同，不同成分在6 个品种不同叶位叶片间含量的变化趋势存在差异。

2.2 枇杷叶主要功能成分和叶位回归分析

表2 枇杷叶主要功能成分含量和叶位回归分析Table 2 Regression equations of the main functional components of loquat leaves versus leaf position

由2.1节分析可知，枇杷叶主要功能成分含量随叶位的增加呈现一定变化规律，因此通过回归分析法[27]以叶位值X为自变量，功能成分含量Y为因变量进行线性回归，结果见表2。12 种功能成分中，由于儿茶素含量在不同品种枇杷叶中随叶位的变化趋势差异较大，因此表现出与叶位值关系不明显，另外11 种主要功能成分含量均与叶位值存在极显著线性相关（P＜0.01）。其中，总酚、黄酮、总三萜酸、熊果酸、齐墩果酸、科罗索酸和没食子酸含量与叶位值呈正相关，新绿原酸、绿原酸、芦丁和异槲皮苷含量与叶位值呈负相关。

科罗索酸、新绿原酸含量与叶位值相关系数较大，均在0.8以上，回归方程的决定系数较高，表明叶位对枇杷叶片科罗索酸和新绿原酸含量影响较大，且在不同品种中随叶位的变化较为一致。熊果酸和异槲皮苷含量与叶位值相关系数较低，决定系数过小，表明叶位对熊果酸和异槲皮苷含量的影响较小或存在品种差异。

2.3 枇杷叶主要功能成分比较

表3 枇杷叶主要功能成分比较Table 3 Comparison of the contents of the main functional components in loquat leaves from different varieties

如表3所示，总酚、黄酮、总三萜酸、熊果酸、齐墩果酸、儿茶素、新绿原酸和异槲皮苷在不同品种枇杷叶中含量范围分别为12.89～30.78、31.43～85.17、13.54～30.37、12.29～16.88、2.12～2.84 mg/g，22.33～274.44、106.71～243.59 mg/100 g和1.43～4.75 mg/100 g，在‘大五星’枇杷叶中含量最高，显著高于其他5 个品种（P＜0.05）。科罗索酸和没食子酸在不同品种枇杷叶中含量范围分别为3.69～5.44 mg/g和4.21～6.85 mg/100 g，在‘麦后黄’枇杷叶中含量最高，显著高于其他5 个品种（P＜0.05）。绿原酸和芦丁在不同品种枇杷叶中含量范围分别为87.23～185.72 mg/100 g和1.09～3.70 mg/100 g，在‘白茂木’枇杷叶中含量最高，显著高于其他5 个品种（P＜0.05）。

2.4 枇杷叶主要功能成分主成分分析

表4 主成分的特征值及方差贡献率Table 4 Eigenvalues of first three principal components and their contribution rates to the total variance

对所测30 个样本12 个主要功能成分进行主成分分析，按特征值大于1.0的原则[28]所得相关矩阵的特征值和方差贡献率见表4。提取的3 个主成分累计贡献率为84.786%，可代表原始数据的大部分信息。其因子负荷矩阵和旋转后因子载荷矩阵见表5。

表5 因子负荷矩阵Table 5 Loading matrix of first three principal components

主成分的载荷矩阵旋转之后载荷系数更接近1或者0，得到的主成分能够更好地解释变量[29]。旋转后第1主成分主要受新绿原酸、绿原酸的正方影响；第2主成分主要受熊果酸、齐墩果酸、儿茶素的正方影响；第3主成分主要受总酚、黄酮、总三萜酸的正方影响。

表6 枇杷叶综合得分排名Table 6 Comprehensive score ranking of loquat leaves from different varieties

将原始变量进行标准化消除不同单位和数据量纲的影响后[30]，参考万红兵等[31]主成分得分和综合评价函数，对不同品种枇杷叶进行各主成分得分和综合得分的排名，结果见表6。‘大五星’枇杷叶3 个主成分得分和综合得分均排名第1，‘麦后黄’和‘白茂木’2 个品种枇杷叶第1、2主成分得分和综合得分排名靠前，‘马克’和‘佳伶’2 个品种枇杷叶第3主成分得分排名靠前，这一结果与2.3节各品种主要功能成分比较结果基本一致。

3 结 论

同一采回期内，枇杷叶主要功能成分随叶位增加有一定变化，其变化趋势与品种有关。‘大五星’、‘马克’、‘佳伶’3 个品种枇杷叶总酚、黄酮、总三萜酸含量随叶位的增加而上升，而在‘白茂木’、‘麦后黄’、‘长崎早生’3 个品种枇杷叶中此变化不明显。这可能与不同品种枇杷叶遗传物质的差异以及枇杷叶内功能成分生物合成和代谢机理有关。本研究只涉及一个时期枇杷叶主要功能成分随叶位的变化，对于不同季节枇杷叶功能成分含量以及与叶位间的变化规律，还有待进一步深入研究。

本实验研究的功能成分中，有11 种成分含量与叶位值存在显著的线性相关性，其中，7 种成分呈现正相关关系、4 种成分呈现负相关关系，因此利用叶位可以对枇杷叶功能成分含量做出评价。通过对6 个品种枇杷叶主要功能成分的比较和综合评价，结果表明‘大五星’枇杷叶8 个主要功能成分含量显著高于其他5 个品种，综合评价居于首位，适合功能成分的综合利用；‘白茂木’更适合于以绿原酸和芦丁为主要成分的开发利用，‘麦后黄’更适合于以科罗索酸和没食子酸为主要成分的开发利用。在枇杷叶的利用中应考虑品种以及叶位的影响，并根据实际应用需求选择适合的品种并规范相关采回标准。