王宇，孙嘉蕾，韩雪

（哈尔滨工业大学化工与化学学院，黑龙江哈尔滨150001）

地球上有80%左右的表面处于15℃以下，深海地区、高寒地区、永久冻土地区以及极地地区占据了地球的决大部分。在这些极端的地区，具有嗜冷特性的古细菌、细菌和病毒等微生物得以大量繁殖，构成了寒地地区的微生物系统[1]。嗜冷菌是一类菌的总称，这类菌一般是在-15℃～20℃之间最适宜生长，由于这个温度段与其它菌最适宜的温度段相比要冷很多（普通细菌适应生长温度为25℃～40℃），故得名嗜冷菌。嗜冷菌能够在低温环境下生长繁殖，其对低温环境能够做出应答并拥有自己独特的嗜冷机制。细菌的生长需要维持细胞膜的流动性用于营养物质的运输、遗传物质的复制用于繁殖。低温条件的限制就要求嗜冷菌能够在低温条件下实现物质的运输以及遗传物质的复制，这也要求嗜冷菌能够产生低温下具有活性的各种生物结构。这类嗜冷微生物储量丰富，是潜在的微生物资源。因其能合成分泌在极端环境下具有催化作用的酶而成为研究热点[2]。大量的嗜冷菌构成了一个天然的酶库，这些酶正在逐渐被人类所利用。近年来，人们对极冷环境下能够大量繁殖的嗜冷微生物给予了更多的关注，旨在阐明其嗜冷机制并应用于现代工业当中。当低碳环保成为了人们日益追求的目标，寻找低温条件下能够保持活力的酶就成了研究的热点问题，研究者们把目光投向给了能在低温条件下正常生长的嗜冷菌及其产生的低温条件下依然具有活性的各种酶类。目前已有多种酶类在生物降解、生物医药、食品纺织领域具有较成熟的应用，但依旧有许多潜在的酶类等待人们去挖掘利用。本文综述了嗜冷菌的嗜冷机制以及其在食品领域的应用，旨在为后续嗜冷菌的研究提供新的思路。

1 嗜冷菌的嗜冷机制研究现状

1.1 细胞膜流动性的调节

细胞膜作为阻止细胞外物质自由进入细胞的屏障，既保证了细胞内环境的相对稳定，同时又是细胞与外界环境进行信息交流、物质交换的转运媒介。维持细胞膜的流动性又是细胞实现信息交流、物质交换的必要条件。通常在低温条件下，细胞膜会因物理变化而使细胞膜的流动性降低。因此，嗜冷菌想要维持正常的生命活动就需要能够对外界温度降低做出应答，同时维持细胞膜的流动性[3]。

在低温的条件下，原核细胞的细胞膜会变得坚硬，想要维持细胞正常的生长代谢，细胞膜上的脂肪酸就会发生一系列化学变化来防止细胞受到低温损伤。其中的途径之一就是通过修饰脂质或者合成新的脂质，利用凝胶到液相结晶相转移的方式来维持膜流动性。主要的改变发生在主链上，在增加主链上的不饱和基团和甲基数量的同时，降低主链的链长增加分支。这种膜的适应过程被称为自黏性适应。多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）是指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸。与单不饱和脂肪酸相比，多不饱和脂肪酸具有更低的熔点，因此，增加多不饱和脂肪酸的含量能够增加细胞膜的流动性。不同类型的细菌合成不饱和脂肪酸的方式不同，厌氧细菌通过从头合成的途径合成不饱和脂肪酸，而好氧细菌则是采用先合成再修饰的方式合成的[4]。Stanislava等[5]研究发现南极嗜冷黄杆菌属在冷适应性反应中主要有两种膜流动性的作用机制。第一种机制是基于脂肪酸的不饱和度；第二种机制是基于合成支链脂肪酸。Chintalapati等[3]研究发现，细菌除了可以通过改变脂肪酸的组成来调节细胞膜的流动性之外，还可以通过改变脂质头部、膜的蛋白质含量、合成的类胡萝卜素的类型以及顺反式脂肪酸的比例来改变细胞膜的流动性。除了脂肪酸，脂质双分子层中的蛋白也被认为是维持细胞膜稳定性的重要原因。Maayer等[6]研究发现膜转运蛋白的上调能够抑制低温条件下扩散速率和转运速率的降低。随着生物信息学的发展，又将研究扩大到了小分子物质。通过对嗜冷菌和嗜温菌的膜蛋白进行比较生物信息学分析揭示了嗜冷菌同嗜温菌膜蛋白的氨基酸组成的不同，位于双层外部的序列中的异亮氨酸的增加可能是由于异亮氨酸的疏水性和螺旋去稳定性导致细胞膜的稳定性降低同时柔韧性增加。此外，膜蛋白中丙氨酸的减少可减少螺旋的形成从而降低细胞膜的稳定性[7]。

近年来，关于嗜冷菌细胞膜流动性的调节研究主要是通过调节细胞膜的脂肪酸组成（脂肪酸不饱和度、脂肪酸链长和分支等），以及细胞膜中的其他化学成分（蛋白质、胆固醇和胡萝卜素等）。随着生物信息学的发展，将维持嗜冷菌细胞膜的流动性定位到了氨基酸等小分子层面，关于维持细胞膜流动性的动态变化机制依旧是今后的研究热点。尽管目前对嗜冷菌的细胞膜的独特结构有了一定的了解，也简单的解释了嗜冷菌细胞膜能够抵抗外界低温环境的原因，但是对于其特殊结构的形成以及作用机理并未能做出详细透彻的解释。在今后的研究中，对于嗜冷菌细胞改变细胞膜流动性的代谢通路还需要进行进一步的研究，代谢通路的研究也可为其他物种适应低温环境提供有效的指导意义，旨在低温条件下能够实现工厂化生产，有效的降低生产成本。

1.2 抗冻蛋白

抗冻蛋白（antifreeze proteins，AFPs）是一类具有提高生物抗冻能力的蛋白质类化合物的总称。它们首先在南极鱼的血液中被发现，随后在细菌、真菌、硅藻、植物、昆虫和甲壳类动物中均有发现。在自然界中存在各种类型的具有不同结构的AFPs，糖基化和酯化是最常见的AFPs修饰方法，AFPs的分子量一般为2 kDa～50 kDa[8]。AFPs具有两种不同的活性：热滞活性和冰重结晶抑制活性[9]。这些活性都归功于AFPs对冰的亲和力。AFPs能改变冰晶的结构并抑制冰的重结晶来保护细胞膜免受冷冻损伤，从而保证嗜冷微生物在低温条件下的正常存活。有研究发现，AFPs通过不可逆的结合特定的冰晶面起作用，从而阻止二次成核并形成独特的冰形态。由于开尔文效应的存在，吸附的AFPs之间的冰表面发生膨胀致使冰面的局部弯曲，也导致了热滞后效应的出现[9]。从鱼类到植物再到细菌，许多生物都通过AFPs来延缓冷冻或者减少冷冻和解冻时造成的伤害。

Duman等[10]首次证明了AFPs存在于冷适应细菌中，莫拉式菌是第一个被报道的可以产生AFPs的菌株。Muryoi等[11]利用由分离的AFPs的部分氨基酸序列设计的引物，通过PCR和反向PCR克隆具有编码473个氨基酸的开放阅读框的DNA片段。预测的基因产物AFP-A在大肠杆菌中表达产生了用糖和脂质修饰的分子量为72 kDa的胞内蛋白。Yamashita等[12]从南极洲罗斯岛筛选出了6株能产生防冻蛋白的细菌。其中，被鉴定为莫拉式菌产生的抗冻蛋白具有活性最高。其产AFPs的最佳温度和pH值分别为5℃和7.0。上清液中的AFPs经60%硫酸铵部分纯化，仅从聚丙烯酰胺凝胶电泳洗脱得到分子量为52 kDa的蛋白条带，发现其通过形成六方晶体显示出抗冻活性。通过脂质染色试验和酶处理证实了该AFP是一种脂蛋白，并且没有冰成核活性。

Hashim等[13]对嗜冷酵母Glaciozyma antarctica基因组进行测序鉴定出了一种新的抗冻蛋白基因，该cDNA编码了含有177个氨基酸的蛋白质AFP-1。通过实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）定量了 AFP-1 的表达水平，在-12℃下生长6 h内检测到最高表达水平。将该抗冻蛋白的cDNA克隆到大肠杆菌表达系统中，重组AFP-1在大肠杆菌中的表达导致包涵体的形成，随后用尿素处理使其变性并在体外再折叠，重组AFP-1的热滞值高达0.08℃。随后，Tab等[14]将来自Glaciozyma antarctica的重组AFP-1在甲基营养酵母中过表达，在16℃和pH 5.0的条件下，获得AFP-1的最高产量39.5 mg/L。通过热滞后和重结晶抑制显示出抗冻活性，且活性与蛋白质浓度相关。AFP-1的活性受温度影响，在温度高于20℃时活性显著降低，这也说明AFPs是针对低温环境产生的特异性应答。

近年来，出现了关于抗冻蛋白的大量的报道。众多学者都从嗜冷微生物中发现了抗冻蛋白，并对其抗冻效果进行了比较研究，利用克隆的方法来生产出目标抗冻蛋白是目前主流的研究方法，大肠杆菌是常用的工程菌。克隆法因其操作方便，同时生产效率高备受研究者的喜爱，但利用克隆法生产出的抗冻蛋白可能与原始的抗冻蛋白具有结构上的差异。另外，关于抗冻蛋白的结构及其构效关系研究的并不透彻，并没有详细的文献阐明抗冻蛋白提高细胞抗冻能力的机制。今后，对抗冻蛋白的构效关系的研究可能会成为热点，构效关系的阐明也对蛋白改造具有重要的指导借鉴意义。

1.3 冷休克蛋白

冷休克是细胞在低温条件下发生的休克反应，它是细胞膜、核糖体、核酸和蛋白质等不同水平的特异性反应。嗜冷微生物长期处于低温环境下，为了保持正常的生长繁殖，则需要对冷休克反应做出特异性的应答。嗜冷微生物在低温条件下会诱发产生冷休克蛋白（cold shock proteins，CSPs）抑制冷休克反应，帮助嗜冷微生物适应低温条件[15]。冷休克蛋白可以与单链核酸结合并充当RNA伴侣以调节翻译。冷休克蛋白在冷休克适应阶段达到最高值，随后冷休克蛋白的合成速度下降，并维持一个相对稳定的水平。

Goldstein等[16]研究发现将处于指数生长的大肠杆菌从37℃转移到10℃时，显著诱导产生一种分子量为7.7 kDa的蛋白质，并命名为CS7.4。当温度处于10℃时，CS7.4的产率在1 h～1.5 h内达到总蛋白合成的13%，随后下降到较低的基础水平。CS7.4的表达调控非常严格，在37℃时检测不到该蛋白的合成。因此，可以得出该蛋白是菌体对低温环境做出的特异性应答。接着，Goldstein等又克隆了编码该蛋白的基因，并完成了核苷酸序列分析，发现该基因编码了含有70个氨基酸残基的亲水性蛋白，但并未对其结构进行阐明。Lee等[17]通过对单增李斯特菌的冷休克蛋白Lm-CspA研究显示，该蛋白是五链β-桶结构，具有疏水核心和两个盐桥。Lm-CspA具有较低的熔融温度（40℃），表面环长、疏水中心少、盐桥多和静电斥力差可能是造成Lm-CspA热稳定性差的关键因素。

1.4 冷活性酶

酶是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA。活细胞内每时每刻都在进行着大量的酶促反应，来维持细胞正常的生命活动。由于嗜冷菌独特的低温环境，要求嗜冷菌在低温条件下能够完成一系列生化反应，也就要求嗜冷菌具有能在低温下具有活性的酶。

Bai等[18]从天山永久冻土分离出36株冷适应菌株，经鉴定11株可产生冷活性蛋白酶，3株可产生冷活性淀粉酶，11株可产生冷活性脂肪酶，8株可产生冷活性纤维素酶。Morita等[19]从由雪覆盖的土壤和深海鱼中分离的细菌中获得了3种蛋白酶，它们对低温表现最高活性，在温度达到30℃时活性消失，说明这3种酶具有冷活性。通过16S rRNA分析，3种酶中活性最高的酶来自黄杆菌，该菌的最佳生长温度为20℃，但在10℃下存在较高量的蛋白酶活性。

Alquati等[20]发现由莓实假单胞菌产生脂肪酶在低温下具有活性，并通过同源性建立了其三维结构模型，并与铜绿假单胞脂肪酶（45%序列同一性）和洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶（38%序列同一性）进行比较。模型中鉴定了已知脂肪酶共有的催化三联体（S80、D238和H260）和氧阴离子孔（L17和Q84）；蛋白质表面暴露的大量带电残基在冷适应中被反复修饰；保守的二硫桥可能是有助于提高冷活性酶的活性。

迄今为止研究的大多数嗜冷酶的特征是在低温到中温条件下具有更高的催化活性，与嗜温和嗜热的同源性酶相比，冷活性酶的最佳温度更低，但稳定性差。冷活性酶通过降低活化焓ΔH降低了活化能ΔG和反应的温度依赖性。近年来，众多技术都被应用于冷适应酶的结构和功能的分析。但由于蛋白质结构的复杂性，及其变化的多样性，增加了分析的难度，需要进一步进行比较研究。尽管使用如核磁共振等较先进的技术能够较好的分析冷适应酶的灵活性，但还存在很多的局限性。目前普遍认为，嗜冷菌产生的冷活性酶具有很高的灵活性，通过增加可塑性和特性区域或者整个蛋白的灵活性来克服低温的挑战。在这种结构层面，这种增加的灵活性主要是通过减少稳定相互作用的数量或强度来实现，例如氢键、盐桥、芳香相互作用、二硫键、离子结合位点和疏水相互作用。关于冷适应酶的灵活性的构效关系还需进一步研究。

酶作为细胞内一系列生化反应的高效催化剂，它严重影响着生物体生长代谢的每个阶段。冷活性酶由于其独特的低温活性，在众多领域都有巨大的应用潜力，因此提高酶的生成量以及优化酶的分离纯化方法，将是今后工业应用上的研究重点。想提高冷活性酶的产量，则必须阐明酶的生物合成途径，了解酶的代谢通路。通过提高目标酶合成途径的关键酶的活性来提高目标酶的产量和抑制反馈调节抑制将会是未来研究的重点。另外，关于冷适应酶的低温活性机制也没有得到详细的阐述。

2 嗜冷菌在食品领域的应用

尽管有大量研究报道，嗜冷菌是影响乳及乳制品品质的重要因素之一，其产生的胞外蛋白酶和脂肪酶具有一定的耐热性，在加热灭菌后仍能保持一部分活性，在乳及乳制品的储藏过程中残存的具有活力的酶会继续对蛋白质、脂肪底物进行分解，产生小分子的具有不利气味的小分子肽和脂肪酸，影响乳及乳制品的品质。但也正是因为嗜冷菌产生的酶具有低温活性和热抵抗性，从而可以应用于众多领域，本文综述了嗜冷菌在食品领域的应用。

事实上，冷活性酶在食品工业中是一种非常强大的工具。为了避免对食品口感、质地和营养价值造成不利影响，同时也为了节约能源，在低温条件下处理食品的趋势越来越明显[21]。目前世界上约有30%的人口患有乳糖不耐症，乳糖不耐症影响着乳糖不耐症人群对牛奶的摄取，Nam等[22]研究发现假交替单胞菌KNOUC808具有产β-半乳糖苷酶的能力，该菌产生的β-半乳糖苷酶能够在相对低温条件下将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，该乳糖水解酶的最佳温度和pH值分别为20℃和7.8，该酶在4℃条件下有效期为7 d，但在37℃时活性下降到初始活性的50%左右。研究发现，从嗜冷菌中分离出的冷活性β-半乳糖苷酶在工厂的循环使用过程中活性损失较小，在每次反应过程中仅损失5%（90℃）和1%（10℃）的活力，在最佳条件下反应10个循环依旧能保持54%（90℃）和88%（10℃）的活力剩余[23]。马宏伟等[24]从高山冻土和乳制品中分离出的25株嗜冷菌筛选出1株高产β-半乳糖苷酶的菌株C，并发现在4℃低温的条件下，该酶的依然具有30%的活力，如果能将该酶应用到乳制品中，那么将会在较低温条件下进行乳糖的分解，同时可以降低反应体系能量，节约能源降低成本，这也将会是乳糖不耐症患者的福音。

另一方面，嗜冷菌在果蔬加工领域也有着重要的作用。Adapa等[25]考虑使用从嗜冷微生物获取的冷活性的果胶酶来代替常规果胶酶，来适应低温加工的新趋势。葡萄酒行业也是冷活性果胶酶潜在应用领域，葡萄酒是通过发酵工艺产生的，与其他发酵工艺相反，葡萄酒房角需要在低温条件下（10℃～15℃）下进行。果胶酶在葡萄酒领域主要有以下方面：（1）从葡萄中提取有效的汁液；（2）将发酵醪中的悬浮颗粒沉淀；（3）释放色素以及香气。Margesin等[26]研究发现，从酵母菌和真菌中分离出来的冷活性果胶酶被认为能增加挥发性化合物的产生和保留，从而改善葡萄酒的芳香特性。从嗜冷菌中分离出的聚半乳糖醛缩酶也在果汁领域具有重要的应用，一种名叫Endo-PGⅠ的聚半乳糖醛缩酶能够使木瓜汁的浓度降低17.6%，透光率提高59.1%。与商品果胶甲酯酶一同使用，协同度大于1.25[27]。随后，有研究表明从黄曲霉属中分离出的一种酸性的、冷活性的果胶甲酯酶PE8F46能够与乳酸钙结合来显著增加菠萝的硬度[28]。因此，考虑到低温条件下对果蔬品质的影响，恰当的冷活性酶将会是果蔬加工行业的理想选择。

在淀粉加工领域嗜冷菌也具有重要的应用。木聚糖酶可以水解面粉中的β-1，4木聚糖，用于提高面包质量，而冷活性的木聚糖酶能够在面团低温情况下有效的水解β-1，4木聚糖。Struvay等[29]研究发现，由南极浮游假交替单胞菌产生的冷活性木聚糖酶能有效的改善面团的力学性能和面包的最终品质，是一种潜在的工业面团调理剂。来自嗜冷微生物的抗冻蛋白具有抑制冰晶的重结晶作用，将抗冻蛋白应用于冰淇淋等冷冻食品来增加其细腻口感也是一种重要的潜在应用。抗冻蛋白还具有作为冷冻保护剂的明显潜力，并已被证明能够提高生物材料和冷冻保存效率和解冻后的生存能力。如果能将抗冻蛋白应用于材料的保护中去，那么将有极大的潜力来降低材料在冷冻储藏过程中的损伤情况，将极大的提高材料的利用率并降低成本。

随着嗜冷微生物在食品中应用的增加，对其安全性的评价刻不容缓。部分嗜冷菌属于条件致病菌，在对其进行食品上的应用前，对其进行安全性评价则成为必要步骤，用以保障食品安全。嗜冷微生物在食品领域中的应用主要是其产生的具有独特生物学特性的酶类发挥作用，因此在分析目标酶在食品中的应用过程中，也要将目光聚焦在通过人为改变培养条件或者人为改造微生物的代谢通路来提高目标酶的产量。通过改变培养条件来确定目标微生物的最适产酶条件是最常见的提高产量的方法，随着生物技术的发展，通过改变微生物的代谢通路，挖掘目标酶合成的关键蛋白并进行调控以及反馈抑制的解除日渐成为了研究的重点。与此同时，优化目标酶的分离纯化途径也将是今后研究的重要热点。

3 总结

近年来，嗜冷菌及其嗜冷机制成为了研究热点，由于嗜冷菌独特的生存环境要求其自身具备能在低温环境下实现所有的生命活动。其中，不饱和脂肪酸、抗冻蛋白、冷休克蛋白以及冷活性的产生帮助其实现生命活动的正常进行，同时这些生物分子也在生物降解、食品医药等领域具有良好的发展前景。本文旨在综述嗜冷菌的嗜冷机制及其应用，为今后嗜冷菌的研究提供新思路。