洪跃辉，李文哲，陈栋华，薛金满，王江海

（1.广东江门中医药职业学院，广东江门 529000；2.中山大学海洋科学学院，广东广州 510006）

细胞色素P450是一类分布广泛的血红素蛋白超家族末端单加氧酶，是生物界中最具催化多样性的催化剂[1-2]，能使多种难降解物质转化为可生物降解的化合物，在环境保护（如石油污染修复、化学制药废水的处置）和农业等领域中具有广阔的应用前景[3]。其中P450在环境修复方面的应用探索是近年来国际上的研究热点之一。例如，近年来有不少学者将P450基因导入植株中，用于清除杀虫剂、除草剂等环境污染物[4]。

虽然目前已分离鉴定出不少P450酶，但目前已知的天然P450酶对难降解物质的催化活性较低[4]。因此，在面临环境污染物种类和数量依然不断增加的情况下，寻找具有新催化活性的P450酶或通过基因改造来改善现有酶的性质具有非常重要的科学意义。目前已经有一些对P450基因进行改造的成功例子。例如，李红梅[5]以P450 BM-3为研究对象，从该亲本酶改造出具有新催化特性的酶，并且提高了酶活性，使其应用前景变得更加广阔。为了对P450基因进行有针对性的改造，必须对其基本性质有较深入的认识。

无色杆菌HZ01（Achromobacter sp.HZ01）是能高效降解石油烃和合成新型脂肽类表面活性剂的海洋新菌株[6-7]。Hong等[8-9]采用全基因组和转录组测序剖析了该细菌的遗传背景，预测出一种P450酶在该细菌降解正构烷烃的末端氧化途径中发挥重要作用。该研究虽然已经获得了无色杆菌HZ01的细胞色素P450基因序列，但该P450的性质仍未明晰。本研究通过生物信息学分析揭示该P450的基本性质，为后续基因克隆表达、基因改造以及酶的工业化生产等深入研究和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 序列下载

从NCBI网站下载无色杆菌HZ01的细胞色素P450基因序列和蛋白序列。基因序列编号为LWKV01000001.1:c1088606-1086252，蛋白序列编号为WP_111825096.1。

1.2 蛋白质理化参数分析

采用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析菌株HZ01_P450的理化性质，包括氨基酸组成、等电点、消光系数、不稳定指数、亲水性平均系数等[10]。分析时与Alcanivoraxborkumensis SK2的P450进行比较。

1.3 开放阅读框（open reading frame，ORF）查找

采用NCBI网站的ORFfinder工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找HZ01_P450基因的开放阅读框。

1.4 系统进化树分析

采用MEGA 6.06软件对细胞色素P450序列进行系统进化树分析。

1.5 亲疏水性分析

使用ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）分析HZ01_P450的亲疏水性特点[11]，并与Alcanivoraxborkumensis SK2的P450进行比较。

1.6 跨膜区分析

采用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对P450进行跨膜区分析[12]。

1.7 信号肽预测

采用SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）对P450进行信号肽预测[13]，参数设置选择神经网络法。

1.8 二级结构预测

使用SOPMA对P450进行二级结构预测[14]。

1.9 三级结构预测

使用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org）预测P450的三级结构[15]。

1.10 蛋白功能域预测

使用SMART软件（http://smart.embl-heidelberg.de/）预测P450的功能域。

2 结果与分析

2.1 理化参数

采用ProtParam对细胞色素P450的理化性质进行分析，结果如表1所示。P450序列中亮氨酸残基含量最高，占9.1%。与Alcanivoraxborkumensis SK2比较，菌株HZ01_P450的氨基酸残基数目、分子量和原子总数都大于前者。AlcanivoraxborkumensisSK2是广泛存在的一种海洋细菌，能以石油烃为唯一碳源和能源。Schneiker等[16]采用高通量测序从该细菌中鉴定出与烷烃降解相关的细胞色素P450。前期通过比较基因组分析发现，菌株SK2的基因组比HZ01小，且基因组较精简[9]。菌株SK2_P450的氨基酸残基数目、分子量和原子总数较小的原因可能与其基因组精简性有一定关系。

表1 细胞色素P450的理化性质

从表1的理化参数结果可知，两种P450的亲水性平均系数（GRAVY）都为负数，这说明这两种P450属于亲水性蛋白。预测等电点都小于6.50，这一数据在后续对HZ01_P450进行分离纯化或电泳鉴定时，可作为一个重要的参考信息，有助于选择合适的缓冲液。不稳定指数（instability index）可用于评估蛋白质的稳定性，当某种蛋白的不稳定指数小于40时，被预测为稳定蛋白；当不稳定指数大于40时，则该蛋白可能是不稳定的[17]。表1显示，两种P450的不稳定指数估测值分别为49.15（菌株HZ01）和40.12（菌株SK2），表明它们可能是不稳定蛋白。这一结果提示，在后续HZ01_P450的应用中，需要考虑其不稳定性，这一性质可作为基因改造的一个着手点。

2.2 开放阅读框

开放阅读框查找结果如表2所示，在HZ01_P450基因中查找到13个ORF，有6个ORF位于正链，ORF1最长（2355 nt/784 aa），位于＜1至2355 bp区域。

2.3 系统进化树

系统进化树分析结果如图1所示，无色杆菌HZ01的细胞色素P450与木糖氧化无色杆菌（Achromobacterxylosoxidans）的P450聚在一起，为一个单独分支，说明这两种P450的亲缘关系较近；而菌株HZ01_P450与菌株SK2_P450的亲缘关系则较远。从图中还可以看出，与无色杆菌属（Achromobacter）的P450聚类较近，而与其他种属细菌的P450聚类相距较远。

图1 P450的系统进化树

2.4 亲疏水性

使用ProtScale分析了细胞色素P450的亲疏水性，结果如图2所示。图中的横轴表示氨基酸序列的位置，纵轴代表氨基酸的标度值（得分），标度值为负数时代表亲水性，标度值为正数时表示疏水性。在HZ01_P450的氨基酸序列中，标度值小于-2.30的位置分别在第49、197、213、214、215、359、447、763位氨基酸，这些位置可能是HZ01_P450的主要亲水分布区，其中第215位的精氨酸（Arg）具有最低分值（-2.667）。标度值大于2.30的位置分别在第476、477、478、581、582位氨基酸，这些位置可能是HZ01_P450的主要疏水分布区，其中第477位的丝氨酸（Ser）具有最高分值（3.100）。在菌株SK2的P450序列中，第390位的精氨酸（Arg）具有最低分值（-2.956）；第302位的丙氨酸（Ala）具有最高分值（2.500）。两种P450氨基酸序列的最低分值都出现在精氨酸（Arg）位置（虽然分值有微小差别）。在两种P450序列中，有较多区域表现为亲水性，与理化参数分析推测两种P450都属于亲水性蛋白的结果一致。

2.5 跨膜区

蛋白跨膜区是指蛋白质序列中跨越细胞膜的区域，跨膜蛋白的疏水区往往也是其跨膜区[18]。采用TMHMM Server v.2.0进行跨膜区分析时，若整条序列被预测为“inside”或“outside”，则说明该序列不含跨膜螺旋。如图3所示，HZ01_P450序列从头至尾被预测为“outside”的概率值几乎都为1，而且预测的跨膜螺旋数（TMHs）为0，表明该P450不存在跨膜区。目前在原核生物中发现的细胞色素P450系统组分都是可溶的，属于非膜结合型蛋白[19]。根据本研究的理化参数、亲疏水性和跨膜区分析结果推测，海洋新菌株HZ01的细胞色素P450是可溶的亲水性非跨膜蛋白。

2.6 信号肽

采用SignalP 4.1对细胞色素P450序列进行了信号肽预测，选用的神经网络法涉及C、S、Y值，含义分别是：信号肽区域的S值较高，信号肽剪切位点处C值最高，max.Y是综合考虑C值和S值的一个参数。如图4的结果显示，C、S、Y值都较低，且signal peptide参数结果为NO，说明该P450不存在信号肽。

图3 细胞色素P450的跨膜区分析

图4 信号肽预测分析

2.7 二级结构

使用SOPMA软件预测了细胞色素P450的二级结构，结果如图5所示。发现该P450含有4种二级结构：α螺旋（Hh），所占比例是35.08%；延伸链（Ee），占比15.82%；β-转角（Tt），占比6.12%；无规卷曲（Cc），占比最高，为42.98%。

图5 细胞色素P450的二级结构预测

2.8 三级结构

使用SWISS-MODEL对菌株HZ01_P450进行了三级结构预测，结果如图6所示。从三级结构模型可推断，海洋新菌株HZ01的细胞色素P450属于球状蛋白，主要由无规卷曲和α螺旋组成，与二级结构预测结果一致。

2.9 P450的功能域

采用SMART软件在HZ01_P450中预测出2个功能域，结果如图7所示。2个低复杂区域（low complexity region，LCR）分别位于氨基酸序列的2～17和574～586，长度分别为16 aa（LCR1）和13 aa（LCR2）。目前认为，LCR在蛋白质间的功能性结合等多种生物学功能中发挥关键作用，LCR在序列中的具体位置可能与其结合性质和生物学作用密切相关[20]。

图6 细胞色素P450的三级结构

图7 细胞色素P450的功能域

3 结论

本研究通过生物信息学分析首次剖析了无色杆菌HZ01细胞色素P450的基本性质。分析结果主要表明：（1）P450基因中最长的ORF长度为2355 nt；（2）HZ01_P450与木糖氧化无色杆菌的P450亲缘关系较近；（3）在P450序列中有较多区域表现出亲水性，且序列中不存在信号肽；（4）该P450可能是可溶性非跨膜蛋白，二级结构中无规卷曲所占比例最高，三级结构分析结果可推断HZ01_P450属于球状蛋白；（5）SMART软件预测出该P450含有2个低复杂区域。这些结果为无色杆菌HZ01_P450的应用（如环境修复等）奠定了基础，有助于后续进行基因改造、酶的工业化生产等更深入的研究。