郭庆圆 刘洪臣

骨组织含血量约占心排血量的5%～20%，但骨髓是一个缺氧的微环境，骨髓中含有调节细胞增殖分化和信号转导等多种因子，这些因子调节着骨骼各种复杂的病理、生理活动。肿瘤的切除、外伤、感染或其他原因导致的骨缺损，损伤后血流中断或减少而导致局部缺氧。缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)是机体组织、细胞适应低氧或缺氧环境的主要调节因子，包括HIF-1α 和HIF-2α。常氧条件下，HIF-1α 和HIF-2α 被脯氨酰羟化酶(PHD)羟基化，使HIF-1α 与肿瘤抑制蛋白(pVHL)结合，从而导致pVHL 的泛素化和HIF 蛋白的降解[1]。在缺氧条件，PHD 活性下降，HIF 蛋白α 亚基的积累，转运到细胞核中，并与HIF 靶基因上的缺氧反应元件(HRES)结合[2]。缺氧反应基因的转录活化影响许多细胞过程，包括血管生成和糖酵解，从而调节骨骼的发育、修复及促进肿瘤细胞的进展。研究表明HIF 可调节多种靶基因如血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生成素(EPO)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、转铁蛋白、糖酵解酶和转化生长因子-β(TGF-β)的表达[3]，这些靶基因的产物参与细胞凋亡、能量代谢、红细胞生成和血管生成等多种病理生理过程，在细胞和机体的生理反应中至关重要。因此，在机体适应缺氧环境的过程中，HIF-1 起着关键的作用。对于骨骼系统，HIF 对骨和软骨的形成也是十分重要的。骨骼系统中存在多种缺氧反应，HIF 在其中发挥着重要的作用[4]。

1.HIF的结构及生物学特点

HIF 对维护细胞的氧平衡是必不可少的。HIF有三种亚型：HIF-1、HIF-2 和HIF-3。每种亚型都是由α 和β 亚基构成的异二聚体，Semenza等[5]发现了HIF-1 蛋白能特异性地结合于促红细胞生成素基因的缺氧反应元件上，HIF 的α 亚单位包含两个转录激活域：N 端(N-TAD)和C 端(C-TAD)。N-TAD 与氧依赖性降解(ODD)域重叠，从而导致α 亚基结合到VHL 抑癌蛋白上泛素化随后被降解[6]。PHD 是一种氧传感器，它的活性至关重要，并且受氧张力调节。在缺氧条件下PHD 是不活跃的甚至无效的，导致α 亚基积累并被输入细胞核。β 亚基是稳定的，可以检测细胞质和细胞核处于常氧还是缺氧条件下。HIF 的α-β二聚体结合到HIF 靶基因的增强子-启动子区内的HRE 上，从而启动负责缺氧适应的靶基因转录。至今已发现四种PHD 和10 多个由HIF 调节的靶基因。这些HIF 调节的基因参与细胞生物行为的多个方面，包括促红细胞生成素，葡萄糖转运蛋白和VEGF。在不同组织有不同的HIF 亚型的表达并且不同的亚型发挥着不同的作用[7]。

HIF 不仅被缺氧调节，也被一些金属离子(如Mg2+、Ni2+、Cu2+等)、物理因素如超声波和一些细胞因子，包括白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)和成纤维细胞生长因子(FGF)等调节[8]。一个复杂的系统控制着HIF 调节体系，其中涉及多个调控机制，包括转录、翻译、核运输及由下游基因形成的反馈回路。不同的信号转导通路也可以通过磷酸化的α-亚基调节HIF，包括(PI3K)/AKT，p38，细胞外信号调节激酶(ERK)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路[9]。

2.HIF介导骨发育

骨发育主要有两种不同的形成机制，骨膜成骨或软骨内成骨。除了颅面骨发育是由间充质细胞直接分化为成骨细胞(骨膜内成骨)以外，其他的骨骼均来自软骨原基矿化成骨，这一过程被称为软骨内成骨。软骨内成骨过程中，间充质细胞凝聚分化为软骨细胞，形成胚胎生长板。生长板软骨细胞具有很强的增殖能力，在分裂时，它们也会堆积形成柱状层。柱状层的最远端细胞停止增殖，退出细胞周期，分化为肥大软骨细胞，矿化其周围基质。随后，血管侵入软骨膜在骨化中心矿化成骨[10]。

缺氧信号通路是骨发育的关键。胚胎生长板是一种独特的间充质组织(因为它是缺血性的)，由于其无血管性，胚胎生长板具有内缺氧区。遗传实验表明，HIF-1α 是体内这些缺氧的软骨细胞存活的关键因子，HIF-1α 缺乏将导致胚胎生长板缺氧区内大量细胞死亡。此外，间充质凝聚的肢芽也是缺氧的，肢芽内HIF-1α 缺乏将阻滞间充质细胞分化为软骨细胞[11]。

VEGF 是HIF-1α 和HIF-2α 作用的目标，它不仅在调节血管生成和软骨骨化的肥大软骨细胞中表达，也在胚胎生长板内缺氧区内表达。选择性敲除小鼠VEGF 基因导致生长板细胞死亡，相似的现象也出现在HIF-1α 缺失的发育软骨中。此外，在增殖的软骨细胞中VEGF 的表达需要软骨有足够的氧气供应，这由软骨膜内血管生成来实现。因此，HIF-1α 在缺氧性软骨细胞中的促生长功能可能完全或部分通过其下游靶点VEGF 介导。然而，Maes 等对这一假设的验证表明，软骨中HIF-1α基因敲除的致死作用只能通过VEGF 转基因表达部分恢复，提示VEGF 依赖细胞存在自主机制。特别是在软骨细胞内，VEGF 过表达可以阻止细胞凋亡，这有可能是通过增加软骨膜血管数量实现的[11]。这些研究结果表明，VEGF 可能是HIF-1 下游的关键靶基因。不同于HIF-1α 的是，HIF-2α 对生长板发育的作用是可有可无的，在肢芽间充质细胞同时敲除HIF-1α 和HIF-2α 可导致生长板异常，在仅缺乏HIF-1α 的标本中也观察到相同的现象[12]。

3.HIF对成骨细胞和骨细胞的调控

成骨细胞对氧浓度有绝对的要求，氧气的供应可影响成骨型。HIF 的功能与骨生成密切相关，因为HIF 能激活血管生长因子如VEGF 的表达。VEGF 活化给成骨细胞增加了血液供应，增加了它们的供氧量。因此，微血管浸润是软骨内成骨和骨膜成骨开始的一个迹象。在实验中，0.02%氧浓度被认为是缺氧，1%～5%是低氧和18%～21%为常氧。已经有实验证明HIF 调节VEGF 的表达[13]，低氧已被证实是引发HIF 调节VEGF 表达的启动因素。除了HIF 以外的其他因素，如薯蓣皂甙元，可以启动一个与HIF 类似的过程，提高VEGF 基因的表达，甚至在常氧的条件下。许多实验支持缺氧条件下VEGF 的表达主要与HIF-1α 有关的观点，也有实验表明HIF-2α 和VEGF 之间有关联。当人骨肉瘤细胞在24h 1%氧张力的缺氧条件下，VEGF mRNA 水平升高四倍。核提取物免疫印迹显示HIF-2α 的增加呈现时间依赖性，其先于在VEGF mRNA 的表达出现。在缺氧条件下骨细胞中HIF-1α 的表达也可上调，骨细胞内氧的供应取决于体液的压缩力的被动扩散。急性废用，消除了压缩则导致骨细胞的缺氧状态，使细胞内HIF-1α的表达上调[14]。

虽然成骨细胞和骨细胞可能在缺氧的环境中发生适应性反应，多数研究者认为缺氧影响成骨细胞和骨细胞表型的维持。对于成骨细胞，当环境氧浓度从20%降至5%，然后降至2%时，矿化结节可能减少1.7～11 倍。更令人吃惊的是，氧浓度为0.2%可能完全阻止矿化结节的形成。胸苷掺入实验表明，矿化结节形成减少是与成骨细胞增殖率降低相关[15]。缺氧的环境也会影响成骨细胞的表型，使碱性磷酸酶活性、碱性磷酸酶的mRNA 表达水平和骨钙素(OCN)明显降低。另一方面，脂肪细胞表型也可以通过缺氧诱导[16]。细胞外基质中缺氧则成骨细胞产生的胶原组织不良，立即导致骨力学性能的下降[17]。

细胞活力检测显示成骨转录因子Runx-2 对胶原蛋白分泌起着潜在的促进作用。缺氧和低氧导致Runx-2 下调，从而导致Ⅰ型胶原和OCN 的表达减少。抑制骨形成蛋白-2(BMP-2)也可能有助于Runx-2 的下调，用重组BMP-2 预处理成骨细胞能恢复缺氧条件下Runx-2 的表达[18]。这种现象也发生在其他具有成骨潜能的祖细胞中，如脂肪来源的间充质干细胞(ASC)和血管周细胞。在高压氧环境中，HIF-1α 的表达受到抑制，促进成骨，结节形成矿化，碱性磷酸酶活性增加。以牵引成骨模型作为例子，当22.4Gy 照射了一个下颌骨骨折，血管生成与对照相比减少1.7 倍，和成骨作用有显著相关性，而高压氧明显逆转这种损伤[19]。然而，其他研究表明，这一观察结果可能与其他条件有关。例如，已经发现高压氧在10%胎牛血清(FCS)可促进成骨细胞增殖，而2%FCS 可抑制成骨细胞增殖[20]。

4.HIF对破骨细胞的调控

破骨细胞是负责骨吸收的多核细胞，来源于循环系统中单核巨噬细胞系的造血前体干细胞，为氧感应细胞。一些肿瘤细胞(如前列腺癌细胞，乳腺癌细胞与骨巨细胞瘤细胞)可以在肿瘤部位造成严重的骨溶解。这个侵袭现象与HIF-1α 在肿瘤细胞中的高表达有关。缺氧是破骨细胞形成和骨吸收的主要刺激因子。当氧张力从正常水平下调至2%时，破骨细胞最多可以传代21 代。最新研究表明，破骨细胞的大小由白血病抑制因子(LIF)/LIF 受体信号和HIF 通路控制。LIF 通过PHD 转录下调影响HIF-1α，进而增加HIF-1α 的表达。HIF 也被证明是调节破骨细胞的一个主要因子，并能诱导干细胞分化为破骨细胞[21]。在缺氧情况下，破骨相关的因子如肝细胞生长因子(HGF)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)可引起单核来源的破骨细胞和巨细胞瘤细胞的HIF-1α 的表达。HIF 下游基因表达的激活，如Bcl-2，BNIP3，Glut-1 和VEGF。VEGF 会刺激破骨细胞。缺氧条件下骨肉瘤细胞培养基悬浮液能明显促进破骨细胞的分化。当利用小干扰RNA(siRNA)沉默MG-63 的HIF 基因，破骨细胞的数量明显减少，表明进自分泌或旁分泌的VEGF 促进破骨细胞的产生，也解释了为什么特定的肿瘤可以引起骨溶解[22]。此外，因为HIF 是骨桥蛋白(OPN)的上游基因，缺氧的骨细胞会增加其OPN 的表达，OPN 是一种强效破骨细胞趋化剂，它的表达会增加破骨细胞的转移和吸附。研究发现，缺氧通过HIF-1α/BNIP3 调控前体破骨细胞的自噬作用，当前体破骨细胞的胞质内容物发生降解及结构调整后即形成破骨细胞[23]，此外HIF-1α对软骨细胞的存活、增殖、分化和软骨基质的形成也有非常重要的影响[24]。HIF-1α 可以促进间充质干细胞向成骨性细胞系分化，并且增加ALP 的活性和Ⅰ/Ⅲ型胶原的产生[25]。总之，这些研究结果表明，缺氧和HIF-1α 诱导破骨细胞功能增强。

5.结语

缺氧是人正常发育的一个重要的生理因素，并参与许多疾病的发生、发展，胚胎的发育、骨缺损的修复以及肿瘤的转移，HIF-1α 是目前发现的缺氧状态下发挥特异性活性的转录因子。HIF-1α 是通过调节缺氧基因的表达来维持细胞内稳定的氧环境，同时，它还参与调控细胞分化、血管生成、糖代谢、炎性细胞及干细胞归巢等众多生理病理反应，在决定细胞命运中起着重要的作用。此外，HIF 通路在肿瘤细胞适应缺氧的的过程中起着重要的作用，通过激活靶基因调节血管生成、细胞增殖、存活、葡萄糖代谢和迁移。

越来越多的证据表明，HIF 通路中在骨发育的过程中起着重要的作用。新生血管可以向骨损伤处输送成骨细胞和前体破骨细胞，血管内皮细胞还能诱导间充质干细胞分化为成骨细胞系，血管生成因子可以通过刺激内皮细胞产生成骨性生长因子，调节骨祖细胞的募集、成骨细胞的增殖分化及破骨细胞的活性。此外，HIF 通路已被用来作为一种加速骨损伤后愈合的方法，HIF 通路功能的自分泌或旁分泌的方式直接刺激骨髓间充质干细胞和成骨细胞的分化、增殖、迁移和独立的血管生成，从而加速骨矿化。我们需要进一步的工作阐明HIF通路与骨发育之间的关系，并为加速骨修复和再生提供新的方法。