廖光华 代佳君 邓钰蓱 吴自豪 任 强 陈 伟,*

（1塔里木大学生命科学学院/新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆阿拉尔843300）

（2塔里木大学动物科学学院/新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔843300）

奶牛乳腺炎是严重影响奶牛业健康发展的多发病之一。据报道，临床型乳腺炎的平均发病率为33. 41%，隐性乳腺炎奶牛的平均每头阳性率为73. 91%。病原菌的感染是引起牛乳房炎的主要原因，而传染性病原菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，以下简称金葡菌）就是主要致病菌之一。金葡菌引起的奶牛乳腺炎，由于引发产奶量下降、奶品质降低、治疗成本升高和高死亡率而导致巨大经济损失［1,2］。因此，快速鉴定金葡菌可为治疗奶牛临床乳腺炎提供重要用药依据。在分子生物学鉴定方法建立起来之前，人们用传统的生化试验完成细菌鉴定。但随着现代科学技术的发展，人们发现传统的生化试验往往会因为操作的复杂性和操作过程中对试验条件掌控的精准性，从而引起试验结果出现偏差或者无法直接判断［3］，并且同一种属的不同菌株间性状可能不同、同一菌株在重复实验中的结果也可能不同，这导致相当高的误判几率［4,5］，且传统鉴定结果随着分子生物学技术的应用，有些菌种重新进行了分类，其分类地位发生了变化，更加显示出传统生化鉴定的缺点［5］。因此随着分子生物学技术的发展，研究者们提出了采用16S rRNA 基因序列分析这一分子生物学的鉴定方法，该方法较传统意义上的生化鉴定更为准确。16S rRNA 扩增使用的引物是细菌的通用引物，扩增的序列是细菌高度保守的16S rRNA基因部分片段。由于扩增片段高度保守，因此扩增完成后还需要进行测序比对才能确定细菌的种类，不仅增加了细菌鉴定的成本，而且延长了细菌鉴定的时间。因此，针对金葡菌特有的基因扩增，可解决金葡菌PCR快速检测的问题。

研究发现金葡菌含有nuc 基因，编码的耐热核酸酶( Thermostable nuclease, Thermonuclease，TNase) 不仅是金葡菌所特有，而且在不同菌株之间具有较高的保守性［6,7］。同时有研究发现金葡菌nuc 基因有潜在增强其耐药性的能力，加剧了公共安全用药的紧张形势［8］。因此，依赖于nuc基因的特异性，建立灵敏度高、特异性强的PCR 鉴定方法，可用于临床快速鉴定金葡菌，为临床用药指导提供实验依据。与此同时，该基因作为金葡菌的独特毒力因子可为进一步研究金葡菌的耐药性与毒素之间的关系提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品

来自新疆巴州地区某奶牛场随机选择39 头奶牛，每头牛每个乳区10 ml 乳样，共采集111 份乳样，放入无菌试管中，保存于4℃冰盒中带回实验室，立即进行分离。金葡菌（Staphylococcus aureus，ATCC 25923）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，ATCC 35984，以下简称表葡菌)、大肠杆菌（Escherichia coli，S17-1）、乳房链球菌（Streptococcus uberis）及健康兔血由塔里木大学生命科学学院重点实验室提供。

1.1.2 主要试剂及仪器

Tris、SDS、EDTA、16S rRNA 扩增引物、nuc 基因扩增引物［9,10］（见表1）、dNTP、Easy Taq 酶、Easy Taq buffer，均购自上海生工生物工程有限公司；PCR 仪、凝胶成像系统、电泳仪购自Bio-Rad公司。

表1 引物名称及序列

1.1.3 培养基

MSA 培养基（用于选择性划线分离培养金葡菌），MSB 培养基（用于选择性增菌培养），LB 培养基（用于溶血试验中兔血平皿的配制），MHA 培养基（OXOID,UK）

1.2 方法

1.2.1 葡萄球菌的分离、鉴定与保存

从采集的乳样中吸取100µL 乳样分别加入到已进行高压灭菌装有5 ml MSB 培养基的试管中，并对其进行相应的编号后，置于37℃恒温培养箱中培养36-72 h 后，接种到MSA 培养基上，再次置于37℃培养箱中进行培养，培养18-24 h。挑取疑似葡萄球菌的优势菌落进行革兰染色、镜检，确定为葡萄球菌后，进行甘油管-20℃保存备用。

1.2.2 生化试验

1.2.2.1 触酶试验

一张洁净的载玻片上少量3% H2O2，用接种环取少量的待检细菌均匀涂抹于过3% H2O2液面之下，30 s 内观察有无气泡的产生。如果产生气泡，则为阳性（+），反之则为阴性（-）［11］。试验过程中同时在载玻片上做阳性对照（金葡菌ATCC 25923）和生理盐水对照。

1.2.2.2 血浆凝固酶试验

在洁净的载玻片上滴加灭菌的生理盐水1滴，用接种环挑取少量的细菌漂浮于生理盐水中，然后滴加兔的血浆1滴，将其充分混匀，如果细菌凝集成块，则为阳性（+）反之则为阴性（-）［11］。试验过程中同时在载玻片上做阳性对照（金葡菌ATCC 25923）和生理盐水对照。

1.2.2.3 溶血试验

制备普通琼脂（LB）培养基，置于高压灭菌锅121℃，20 min 灭菌后，冷却至50℃左右，加入无菌的兔血，含量为5%即每95 ml 培养基加入5 ml 血液，充分混匀。将血琼脂倒入灭好菌的平皿中至平皿凝固后将活化好的纯化培养分离冻存的葡萄球菌接种到血平板上；置于37℃的培养箱中培养18-24 h，观察并记录结果［11］。如果有溶血圈，则为阳性（+）反之则为阴性（-）。试验过程中同时做阳性对照（金葡菌ATCC 25923）。

1.2.2.4 甘露醇发酵试验

取甘油冻存的分离株接种于高盐甘露醇琼脂（MSA）培养基上，置于37℃恒温培养箱中，培养18-24 h后观察。如果菌落周围由红色变为黄色则表示发酵甘露醇为阳性（+），未变为黄色依旧为红色则表示未发酵甘露醇为阴性（-）试验过程中同时做阳性对照（金葡菌ATCC 25923）。

1.2.3 金葡菌16S rRNA及nuc基因鉴定

从通过镜检筛选为葡萄球菌的菌株中随机选取50 株葡萄球菌进行16S rRNA 基因扩增测序和nuc 基因扩增，同时以非葡萄球菌的大肠杆菌和乳房链球菌、表葡菌ATCC35984和金葡菌ATCC25923作对照，并送至上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果经过GeneBank数据库中的已知序列进行BLAST比对。本实验采用50 µl 16S rRNA PCR 扩增体系：ddH2O(40. 7 µl）、Easy Taq 酶（0. 3 µl）、Easy Taq buffer（5 µl）、dNTP（1 µl）、引 物27F 及1492R 各1 µl。+1 min、55℃退火30 s、72℃延伸2 min、72℃总延伸10 min。同时采用相同的PCR 扩增体系用于nuc基因扩增，选用引物见表1。nuc 基因扩增程序：94℃预变性5 min、94℃变性1 min、55℃褪火30 s、72℃延伸1. 5 min、进行30个循环，72℃总延伸3.5 min。

2 结果与分析

2.1 金葡菌的分离鉴定

从所采的111 份奶牛乳样品中分离出205 株疑似葡萄球菌菌株，经生化试验鉴定得到金葡菌98株，分离率达到47. 8%。205 株细菌生化试验结果统计如表2所示。

2.2 16S rRNA及nuc基因序列分析

根据镜检结果，从中随机选取了50 株葡萄球菌进行16S rRNA 基因的扩增与测序，同时进行nuc 基因PCR 检测，以金葡菌ATCC 25923、表葡菌ATCC 35984、乳房链球菌、大肠杆菌S17-1 进行nuc 基因PCR 扩增。结果表明，其中有40 株能扩增出单一的约279 bp nuc基因条带的葡萄球菌菌株，其16S rRNA基因测序比对结果均为金葡菌。而10株未扩增出单一目的条带的葡萄球菌，其16S rRNA 基因测序比对结果均不是金葡菌，分别为溶血性葡萄球菌（6 株）、腐生葡萄球菌（3株）和解淀粉葡萄球菌（1株）。通过对扩增的279 bp nuc 基因进行克隆测序比对，均为金葡菌nuc 基因片段，且同源性为100%。作为对照菌株的表葡菌ATCC 35984 扩增出两条条带，一条大于279 bp，另一条小于279 bp（见图1）。乳房链球菌扩增出多条不同大小的杂乱条带，而大肠杆菌没有扩增出任何条带。上述结果表明nuc 基因具有高度特异性，通过对nuc基因扩增即可鉴定金葡菌。

表2 205株细菌生化试验结果统计

图1 nuc基因电泳图

3 结论与讨论

随着分子生物学技术的发展, 通过细菌保守序列PCR 扩增来确定其种类的方法被越来越多的应用于病原微生物的分离鉴定。本实验采用高盐甘露醇培养法，筛选出205株葡萄球菌。为建立一种更快速高效的分子生物学鉴定方法，随机选取50 株葡萄球菌，采用16S rRNA 扩增测序和nuc 基因扩增以鉴定细菌的种类。结果显示，其中16S rRNA 扩增测序结果为金葡菌的40株菌，均扩增出清晰的、与预期片段大小相符合的nuc 基因。而未扩增出清晰的、与预期片段大小相符合的nuc 基因的10 株菌均为非金葡菌。同时用已知的表葡菌、乳房链球菌和大肠杆菌作对照，前两者扩增出多条非目的条带，而大肠杆菌未扩增出任何条带。进一步表明nuc 基因的特异性扩增不仅可区别革兰阳性菌的葡萄球菌属和革兰阴性菌的大肠杆菌属，也可区别同属革兰阳性菌的葡萄球菌和链球菌，更可区别同属葡萄球菌属的金葡菌与表葡菌，从而实现特异性扩增来快速鉴定金葡菌。这一结果表明，依赖金葡菌nuc基因的PCR 扩增具有高特异性、高效性的特点，可作为金葡菌特异性检测的分子生物学方法。在本实验中，为了确定金葡菌nuc 基因PCR 扩增的特异性，我们还结合了16S rRNA 基因测序方法，以确定本实验建立的方法是否准确。结果表明凡是扩增出单一279 bp 条带的菌株，其16S rRNA 基因测序结果均为金葡菌。而非金葡菌要么无法扩增出任何条带，要么扩增出的条带不是预期大小，我们能从电泳图上很清楚地判断出来。16S rRNA 基因序列分析在菌种鉴定中是一种有效的方法，但这种方法分析的是细菌高度保守序列，常用于分析不同原核生物间的亲缘关系［12］，但与金葡菌nuc 基因检测靶点的鉴定方法相比区分度较低［13］。而nuc基因是金葡菌特有的毒力基因，其他非金葡菌菌种不含该基因，所以可以作为特定的靶标基因用于金葡菌鉴定。因此，nuc 基因为金葡菌的鉴定提供了更有价值的方法，同时因不需要测序，则大大缩短了细菌鉴定的时间和成本，为及时临床用药治疗提供了保障［14］。同时有研究发现，该基因有潜在增强金葡菌耐药性的能力，可影响公共卫生安全［8］。利用nuc 基因高度特异性的特点，不仅建立了一种特异性强、灵敏度高的金葡菌快速鉴定方法，同时对进一步研究nuc 基因在奶牛乳房炎发生发展中的作用也有一定的意义。